ε和δ亚型微管蛋白复合物2在肝细胞癌中的表达及其与患者预后的关系

肖雪莲，涂康生

（西安交通大学第一附属医院肝胆外科，陕西西安 710000）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，简称肝癌）是全球第三大癌症死亡原因，而全球将近一半的新发和死亡病例发生在中国[1]。早期诊断不足、肿瘤远处转移和术后高复发率等是肝癌预后差的重要原因，其手术切除的5年复发率高达40%～60%，而5年生存率低至14%～18%[2-3]。目前TNM 分期系统、BCLC 分期系统等是肝癌预后的基础模型，然而，大量研究发现与肝癌疾病进展密切相关的标志物能够更好地预测预后[4]，有助于指导肝癌患者临床诊疗，提高患者生存率。

微管蛋白家族包括α、β、γ、ε、δ 这5 个亚型，肿瘤中常存在着一种或多种微管蛋白亚型的表达紊乱，与肿瘤的恶性行为密切相关，主要机制有代谢微环境、癌症信号、耐药性等方面的改变[5-6]。如βIII-微管蛋白在胃癌、肠癌、和神经胶质瘤等多种肿瘤中表达上调，与患者预后不良密切相关，而这可能与抗微管药物抵抗有关[7-8]。在非小细胞肺癌中，上调的βIII-微管蛋白可增加肿瘤细胞糖酵解，减少内质网应激损害，促进细胞生存[9]。微管蛋白最主要的功能之一是由α、β 亚型构成的二聚体形成微管，作为细胞骨架在有丝分裂过程中形成纺锤体调控染色体的分离，在细胞周期过程中发挥关键作用[10]。目前研究较多的主要是α、β 亚型，关于α、γ、ε、δ 亚型与疾病关系的研究鲜有报道。ε 和δ 亚型微管蛋白复合物2 （tubulin epsilon and delta complex 2，TEDC2），也称C16orf59，研究[11-12]发现其在中枢神经系统淋巴瘤、肺腺癌组织中高表达。Huang 等[13]最新研究发现TEDC2 在喉鳞状细胞癌中表达上调，可与SLC35C1、HOXB7 联合作为患者预后标志物，并可促进癌细胞的增殖和迁移。另有研究[14]指出其可能与酒精调控的DNA 甲基化有关。以上研究提示TEDC2 可能在多种肿瘤进展中发挥重要的调控作用，然而，尚无研究报道TEDC2 在肝癌中可能扮演的角色。本研究旨在探讨TEDC2 在肝癌中的表达特点及其与患者预后的关系，以期发现新的肝癌预后预测标志物，帮助改善患者预后。

1 材料与方法

1.1 数据来源

本研究下载了TCGA 数据库中肝癌的转录组数据（肝癌组织374 例，正常组织50 例）和ICGC 数据库中的肝癌的转录组数据（肝癌组织243 例，正常组织202 例）。同时获取了患者的性别、年龄、肿瘤分级、肿瘤分期、生存时间等临床病理资料。泛癌分析通过GEPIA2 （http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）网站进行。

1.2 预后分析

根据TEDC2 表达中位值将患者分为高、低表达组，使用R 语言的survival 包绘制生存曲线，采用Kaplan-Meier 法计算其与生存的相关性。通过单因素Cox 回归模型分析了多临床参数（性别、年龄、肿瘤分级、TNM 分期和T 分期）及TEDC2 表达与预后的关系，通过多因素Cox 回归分析鉴定肝癌的独立预后因子。

1.3 基因富集分析

使用GSEA 4.1.0 对TEDC2 进行基因富集分析（GSEA）。GO 和KEGG 富集分析分别使用的注释基因集分别为c5.go.v7.2.symbols.gmt 和c2.cp.kegg.v7.2.symbols.gmt。

1.4 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件和R 语言对数据进行分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间比较使用非参数检验，多组间比较使用方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TEDC2是多种癌症的预后风险因子

通过GEPIA2 网站探索TEDC2 在泛癌中的表达和预后情况， 发现TEDC2 在肾上腺皮质癌（ACC）、肾透明细胞癌（KIRC）、肾乳头状细胞癌（KIRP）、急性髓细胞样白血病（LAML）、肝癌（LIHC） 和肺腺癌（LUAD） 中表达上调（除ACC和KIRC 外，其他P<0.05）（图1A）。总生存期（overall survival，OS） 分析显示，TEDC2 是这6 种癌症的风险因子，而仅在ACC、LAML、LIHC 中TEDC2 对无病生存期（disease free survival，DFS）的影响有统计学差异（图1B）。

2.2 TEDC2 mRNA 在肝癌组织和正常组织中的表达

鉴于TEDC2 在泛癌中的表达和预后情况，进一步探讨其与肝癌的关系。 TCGA 数据库中TEDC2 在肝癌组织和正常组织中的表达量分别是2.370±1.020 和0.750±2.890，差异有统计学意义（P<0.001）。ICGC 数据库中TEDC2 在肝癌组织和正常组织中的表达量分别是2.170±2.300 和0.400±0.440，差异有统计学意义（P<0.001）（图2）。以上结果表明TEDC2 在肝癌组织中表达量高于正常组织。

2.3 TEDC2表达与肝癌患者临床病理特征的关系

TCGA 和ICGC 数据分析发现，TEDC2 表达与肝癌患者的TNM 分期、T 分期和组织学分级有关，差异有统计学意义（均P<0.05），而与性别、年龄无关（均P>0.05）（表1）。

表1 TEDC2表达与肝癌患者临床病理特征的关系Table 1 The association of TEDC2 expression with the clinicopathologic features of liver cancer patients

2.4 TEDC2表达与肝癌患者预后的关系

以TEDC2 表达中位值为界，将患者分为高表达和低表达两组。TCGA 肝癌患者中高表达组的OS明显低于低表达组（P=0.000），同时，高表达组的DFS 也明显低于低表达组（P=0.000）（图3A）。ICGC肝癌患者中高表达组的OS 明显低于低表达组（P=0.000）（图3B）。

2.5 TEDC2是肝癌的独立预后因子

将肝癌患者性别、年龄、组织学分级、TNM分期、T 分期、TEDC2 表达作为自变量进行Cox 比例风险回归分析，以鉴定患者的预后因素。基于TCGA 数据的单因素分析发现，TNM 分期、T 分期和TEDC2 表达是预后的影响因素，而性别、年龄和组织学分级不是预后的影响因素。同时，ICGC数据的单因素分析也显示TNM 分期和TEDC2 表达对预后的影响有统计学意义。在多因素分析中，TCGA 和ICGC 数据的分析均表明仅TEDC2 是肝癌的独立预后因子（P=0.003，HR=1.866，95%CI=1.238～2.813；P=0.002，HR=2.871， 95%CI=1.452～5.677）（图4）。

2.6 基于TEDC2表达的GSEA分析

为了解TEDC2 影响肝癌患者预后的潜在机制，采用TCGA 和ICGC 数据进行了基于TEDC2 表达的GSEA 分析。分析结果显示，在TEDC2 高表达样本中富集了调控细胞增殖相关的GO 和KEGG 通路，比如染色体分离、G2-M 细胞周期转换、有丝分裂、DNA 复制等（图5）。

3 讨 论

微管蛋白家族包括α、β、γ、ε、δ 这5 个亚型。最早发现α、β 亚型微管蛋白二聚体化形成微管，并在中心体结合的γ-微管蛋白参与下成核，其主要功能是通过控制染色体的正确分离而调控细胞周期[10,15]。随后研究发现了ε、δ 亚型，它们定位于中心体的方式均有别于已知亚型[16]。TEDC2是由ε、δ 亚型微管蛋白组成的复合物，有关ε、δ亚型微管蛋白的研究甚少。本研究发现TEDC2 在包括肝癌在内的多种肿瘤中表达上调，其表达水平与肝癌TNM 分期和组织学分级有关，提示TEDC2 与肝癌进展有关。已有研究[11-12]报道TEDC2在中枢神经系统淋巴瘤、肺腺癌组织中高表达，与本研究结果一致，提示TEDC2 可能在多种肿瘤中发挥促癌角色。本研究发现TEDC2 高表达与多种癌症患者预后不良有关，其中，TEDC2 高表达与肝癌患者OS、DFS 缩短有关，提示其可能参与调控肿瘤进展。Huang 等[13]研究发现TEDC2 可与SLC35C1、HOXB7 联合作为喉鳞状细胞癌的预后标志物。进一步地，单因素和多因素分析表明TEDC2 是肝癌的独立预后因子，提示TEDC2 作为肝癌预后预测标志物的临床应用潜力。关于微管蛋白和癌症关系的研究较多的为β 亚型，研究发现βI-微管蛋白高表达与乳腺癌多西他赛耐药有关[6]，βIII-微管蛋白高表达与非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌等多种肿瘤预后不良有关[17]。这些研究结果表明微管蛋白在癌症进程中发挥重要调控作用，并影响患者预后。

为了探索TEDC2 影响患者预后的可能原因，本研究通过基因富集分析发现TEDC2 高表达组中富集染色体分离、DNA 复制、细胞周期转换等细胞增殖相关的通路，提示TEDC2 可能通过促进细胞增殖调控肿瘤进展，进而影响患者预后。关于TEDC2 对肿瘤细胞恶性生物学行为的影响，仅有1 篇研究[13]报道在喉鳞状细胞癌中，干扰TEDC2 可抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。关于TEDC2 影响细胞增殖和侵袭的具体机制尚不清楚，但现有研究表明其可能通过影响中心体复制而调控细胞增殖。δ-微管蛋白主要位于中心体内部的中心粒，而ε-微管蛋白主要位于中心粒的周围物质，且它的定位与细胞周期密切相关，提示ε-微管蛋白可能与中心体成熟和复制过程有关[18]。ε-微管蛋白是中心粒复制所必需，并参与三联微管的组装和维持[19]。中心体复制过程的严格调控保证了染色体的正确分离和有丝分裂的有序进行[20]，而肿瘤细胞中常存在中心体的过多复制，导致染色体的不稳定性和细胞的异常增殖和侵袭[21]。因此，团队拟在后续研究中进一步探索TEDC2 调控细胞增殖、迁移和侵袭的机制。目前关于微管蛋白与肿瘤生物学行为关系的研究主要集中在β 亚型，其中研究最多的βIII-微管蛋白与多种肿瘤如乳腺癌、膀胱癌和及结直肠癌等肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭以及化疗抵抗等有关[22-24]。其可通过多种机制影响肿瘤的生物学行为，如βIII-微管蛋白可通过调控细胞周期[25]、促进PI3K/AKT 信号的激活[23,26]、促进上皮-间质转化过程[27]、调控M2 巨噬细胞的极化[24,9]等多种方式而促进肿瘤细胞的增殖和迁移。基于微管蛋白在肿瘤进展中的重要调控作用，以微管蛋白为靶点的药物如紫杉类，长春花类生物碱等被陆续开发，表现出一定的抗有丝分裂等效应[28-30]。故探索TEDC2 在肝癌中的作用将有助于开发新的治疗靶点。

总之，本研究首次发现TEDC2 在肝癌中表达上调，可作为肝癌预后预测的独立风险因子。其作为肝癌预后预测标志物的临床应用潜力需后期进行大样本的研究进一步评估。另外，本研究结果提示TEDC2 可能参与调控肝癌细胞的增殖，但仍需后续研究证实并阐明其调控机制，以期挖掘新的肝癌治疗靶点。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。