食管鳞状细胞癌患者组织中lncRNA-TUG1 的 表达与预后的关系

郭 剑 袁丽侠

食管癌（EC）是消化系统中常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内其发病率居恶性肿瘤的第9 位，病死率居第6 位，在亚洲地区及非洲东南部的发病率较高[1]。EC 主要分为食管腺癌和食管鳞状细胞癌（ESCC），其中ESCC 是EC 的主要组织学亚型。在中国，平均每年有15 万左右的EC 患者死亡，其中90%以上为ESCC 患者[2]。ESCC 的发病较为隐匿且早期症状不明显，大多数患者在确诊时已是中晚期，其5 年生存率仅15%左右。因此，亟需寻找一种能够早期诊断ESCC 的生物标志物。

长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度大于200 nt 的非编码RNA，具有广泛的生物学功能，可通过与DNA、蛋白质等大分子相互作用，调控肿瘤的发生和发展。牛磺酸上调基因1（TUG1）位于人类染色体22q12.2，可通过与甲基化的PRC2蛋白结合，调控与生长相关的基因表达[3]。Young等[4]的研究表明，沉默lncRNA-TUG1 可使发育中的视网膜细胞生长减慢，或致其凋亡。研究表明，lncRNA-TUG1 在结肠癌、胃癌等消化系统肿瘤的发生、发展中起着重要作用[5-6]，但目前其与ESCC 相关的报道较少。本研究检测了ESCC 组织中lncRNA-TUG1 的表达水平，并分析其与ESCC患者的临床病理特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2013 年10 月至2015 年10 月在渭南市中心医院行ESCC 根治性切除术的103 例患者的肿瘤组织及癌旁组织（距肿瘤组织边缘＞5 cm）标本。所有组织在采集后均于30 min 内进行速冻处理，并保存于－80 ℃的冰箱中待用。纳入标准：（1）术前未接受放射、化学治疗；（2）术后经病理检查确诊为ESCC；（3）签署知情同意书。排除标准：（1）并发其他恶性肿瘤者；（2）心、肝、肾等重要器官功能不全者；（3）合并自身免疫性疾病者。本研究经医院医学伦理委员会批准。

103 例ESCC 患者中男性70 例（67.96%），女性33 例（32.04%），年龄41～72 岁，平均年龄为（59.81±7.62）岁。根据国际抗癌联盟（UICC）和美国癌症联合委员会（AJCC）于2017 年联合发布的第八版食管癌TNM 分期标准进行分期[7]，其中Ⅰ期25 例，Ⅱ期22 例，Ⅲ期30 例，Ⅳ期26 例；术后经病理检查确诊的分化程度为低分化20 例，中分化32 例，高分化51 例。

1.2 lncRNA-TUG1 水平检测

采用实时定量PCR（real time qRT-PCR）法测定lncRNA-TUG1 的表达水平。使用TRIzol 试剂盒提取ESCC 组织及癌旁组织标本中的总RNA，严格按照试剂盒说明书进行操作。使用酶标仪测定RNA 的浓度和纯度。使用PrimeScriptTMRT Master Mix 试剂盒进行反转录，生成cDNA。使用PCR 仪进行扩增反应，反应条件为95 ℃预变性10 min，之后95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40 个循环。以U6 作为内参，采用2-ΔΔCT法表示lncRNA-TUG1的相对表达量。PCR 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 随访

采用门诊或电话的方式对ESCC 患者进行为期5 年的随访。随访开始时间为术后，第1 年每3个月随访1 次，第2 年每6 个月随访1 次，之后每年随访1 次。随访截至2020 年10 月，以患者死亡作为随访终点事件。

1.4 统计学方法

应用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用独立样本t 检验；计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，采用Cox 比例风险回归模型对ESCC 患者的预后影响因素进行单因素和多因素分析。P＜0.5 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA-TUG1 在ESCC 组织及癌旁组织中的表达水平

lncRNA-TUG1 在ESCC 组织中的相对表达量为3.28±0.26，高于癌旁组织（1.03±0.09），两组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 lncRNA-TUG1 的表达水平与ESCC 患者临床病理特征的关系

根据103 例ESCC 患者lncRNA-TUG1 的相对表 达量的中位数（1.58），将患者分为lncRNA-TUG1高表达组（≥1.58，n＝58）和lncRNA-TUG1 低表达组（＜1.58，n＝45）。结果显示，lncRNA-TUG1的表达水平与患者的年龄、性别、烟酒史及肿瘤位置（靠近咽部者为高位，靠近胃下端者为低位，处于中间者为中位）无关（P＞0.05）；与患者的肿瘤分期、分化程度及淋巴结转移情况有关，lncRNATUG1 高表达组中Ⅲ～Ⅳ期者、低分化者、发生淋巴结转移者的占比显著高于lncRNA-TUG1 低表达组，两组比较差异均有统计学意义（P 均＜0.05）。见表2。

表2 lncRNA-TUG1表达与患者临床病理特征的关系/例（%）

2.3 lncRNA-TUG1 的表达水平与ESCC 患者预后的关系

生存分析结果显示，lncRNA-TUG1 高表达组的5 年生存率为24.14%，低于lncRNA-TUG1 低表达组（51.11%），两组比较差异具有统计学意义（P＜ 0.05）。见图1。

图1 不同lncRNA-TUG1 表达水平的ESCC 患者的生存分析

2.4 影响ESCC 患者预后生存的相关因素

将患者的年龄、性别、烟酒史、肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移、肿瘤位置和lncRNA-TUG1水平作为自变量，将ESCC 患者的预后生存情况作为因变量，纳入Cox 单因素回归分析，结果显示肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移和lncRNA-TUG1水平均与ESCC 患者的预后生存有关（P 均＜0.05）。将单因素分析中P＜0.05 的项目，包括肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移和lncRNA-TUG1 水平作为自变量，将ESCC 患者的预后生存情况作为因变量，纳入Cox 多因素回归分析，结果显示淋巴结转移和lncRNA-TUG1 高表达是ESCC 患者预后生存的独立危险因素（P 均＜0.05）。见表3。

3 讨论

EC 是一种具有异质性且容易高度恶化的消化道肿瘤，在全球范围内具有较高的发病率和病死率，严重威胁人类的健康。在中国，每年有数十万人死于EC，且主要以ESCC 亚型为主。近年来，虽然ESCC 的治疗方式得到了显著改进，但患者的5年生存率并未明显升高。大多数EC 患者早期症状不明显，确诊时常已失去手术机会。因此，寻找一种新的潜在标志物，加强对ESCC 的早期诊断、预防和治疗是当前的研究重点。

表3 影响ESCC 患者预后生存的单因素和多因素Cox 比例风险回归分析

lncRNA 在机体正常的生物学过程中发挥着重要的作用，可调控基因表达，参与染色体重排、组蛋白修饰、转录激活与干扰等过程。此外，lncRNA 也参与了包括肿瘤在内的人体多种疾病的调控。研究表明，lncRNA 与肿瘤的浸润和转移有关[8]。lncRNA-TUG1 最初是在小鼠视网膜细胞中被发现的[4]。Zhang 等[9]的研究发现，lncRNATUG1 在骨肉瘤组织中高表达，且与肿瘤的分期、大小及患者预后密切相关，lncRNA-TUG1 高表达的患者术后生存时间显著低于低表达者。Cai 等[10]的研究表明，lncRNA-TUG1 在神经胶质瘤患者中呈高表达，当其被沉默后，神经胶质瘤细胞对化学治疗的敏感度增高。研究发现，lncRNA-TUG1 在体外可通过介导miR-148a-3p/MCL-1/Wnt/β-catenin轴调控ESCC 的生物学功能和上皮间质转化[11]。另有研究表明，lncRNA-TUG1 可能通过与PRC2 结合，从而在ESCC 的发生、发展中发挥作用[12-13]。本研究结果指出，lncRNA-TUG1 在ESCC 组织中的表达水平显著高于癌旁组织，这提示lncRNA-TUG1 的表达可能与ESCC 的发病有关。此外，本研究还指出，lncRNA-TUG1 的表达水平与患者的肿瘤分期、分化程度及淋巴结转移情况有关，lncRNA-TUG1的表达水平越高，患者的肿瘤分期越高，肿瘤分化程度越低，且更容易发生淋巴结转移，这提示lncRNA-TUG1 可能与ESCC 的转移及恶化相关。

多项研究表明，lncRNA-TUG1 可作为膀胱癌、结肠癌、宫颈癌的预后指标[14-16]。本研究结果显示，lncRNA-TUG1 高表达的ESCC 患者术后生存率显著低于lncRNA-TUG1 低表达者，这提示lncRNATUG1 的表达水平可能可以预测ESCC 患者的预后生存情况。Cox 回归分析结果表明，lncRNA-TUG1高表达和淋巴结转移是影响ESCC 患者预后生存的独立危险因素。该结果提示在临床中需要加强对lncRNA-TUG1 高表达患者的术后监测，必要时予以辅助治疗，以防止疾病复发。

综上所述，ESCC 患者的肿瘤组织中lncRNATUG1 的表达水平较高，且其表达水平与ESCC 的发生、发展及患者的预后生存情况密切相关；监测ESCC 患者lncRNA-TUG1 的表达水平有助于判断病情进展及预后情况。今后需对lncRNA-TUG1在ESCC 中的具体调控机制进行深入探究。