克罗恩病患者组织中激活转录因子4 的表达水平 及意义

项芳芳 李杨亮 陈晓桃 姚寒晖

克罗恩病（CD）是一种慢性肠道炎性疾病，其在欧美国家的发病率较高，以往在中国的发病率较低，近年来随着饮食习惯的改变，在中国CD的发病率呈升高趋势[1]。CD 具有复发率高、并发症多的特点，临床表现主要包括腹痛、腹泻、便血等，病情严重者可发生肠梗阻或穿孔[2-3]。CD 的发病机制尚未明确，内质网应激被证实与CD 的发生、发展密切相关[4-6]。内质网应激可通过诱导上皮细胞死亡，损伤黏膜屏障功能，促进肠道的炎性反应，从而引发炎症性肠病[7]。激活转录因子4（ATF4）是一种碱性亮氨酸拉链蛋白，参与了机体的应激反应、炎性反应及肿瘤生长等多种病理、生理过程。多项研究表明，ATF4 可通过调控内质网应激参与疾病的发生及进展过程，如多发性骨髓瘤[8]、前列腺癌[9]、肝损伤[10]及帕金森病[11]等。由此推测，ATF4 可能通过调控内质网应激参与CD 的发生及发展过程。本研究检测了CD 患者组织中ATF4 的表达水平，并探讨其与患者的炎性反应状态及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

前瞻性选取2015 年2 月至2017 年2 月淮南新华医疗集团新华医院收治的75 例CD 患者作为研究对象，设为CD 组。参照《中国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》[12]中关于CD 的诊断及治疗标准进行诊治。纳入标准：（1）患者体征、症状及影像学检查结果符合CD 的诊断标准；（2）首次诊断为CD；（3）入组前未服用激素类、免疫抑制剂类药物；（4）签署知情同意书。排除标准：（1）合并恶性肿瘤；（2）合并全身感染性疾病；（3）严重心、肝、肾功能不全者；（4）随访失联者。另选取同期在该院行肠息肉切除术的80 例患者作为对照组。CD 组中男性46 例，女性29 例，年龄21～43岁，平均年龄为（28.34±4.93）岁，平均体质量指数（BMI）为（21.78±2.79）kg/m2。对 照组中男性43 例，女性37 例，年龄23～45 岁，平均年龄为（29.61±4.73）岁，平 均BMI 为（22.12±2.93）kg/m2。 两 组 患 者 在 性 别（χ2＝0.911，P＝0.340）、年 龄 （t＝1.637，P＝0.104）、BMI（t＝0.739，P＝0.461）方面比较，差异均无统计学意义（P 均＞0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 临床资料收集和随访

收集患者的年龄、性别、BMI、吸烟史、病变部位、肛周病变、疾病行为、C 反应蛋白（CRP）、红细胞沉降率（ESR）及治疗方案等信息。

CD 患者确诊后，采用电话或复诊的方式对患者进行为期3 年的随访，期间每3 个月随访1 次，了解患者的预后情况。末次随访时间为2020 年3月10 日，以腹腔脓肿、肠梗阻、肠穿孔、消化道大出血、肠瘘、接受肠切除手术或因CD 死亡作为随访终点事件。本研究将在随访期间发生终点事件定义为预后不良，反之，则定义为预后良好。

1.3 CD 炎性反应状态评价

采用简化克罗恩病活动指数（CDAI）评分评估患者的病情严重程度，评分项目包括腹痛、腹部包块、腹泻和伴随疾病[13]。腹痛：轻度疼痛记1分，中度疼痛记2 分，重度疼痛记3 分；腹部包块：可疑包块记1 分，确诊包块记2 分，伴触痛记3 分；腹泻每日1 次记1 分；伴随疾病包括关节痛、虹膜炎、结节性红斑、坏疽性脓皮病、阿弗他溃疡、肛裂、新瘘管和脓肿，每种症状记1 分。简化CDAI 评分为4 项评分之和，其中5～7 分为轻度活动，8～16分为中度活动，＞16 分为重度活动。

采用克罗恩病简化内镜评分（SES-CD）评估末端回肠、右半结肠、横结肠、左半结肠及直肠的病情严重程度，评分项目包括溃疡大小、溃疡面积、受累肠道面积和肠腔狭窄，评分范围由轻至重依次为0～3 分。SES-CD 评分为各肠段4 项评分之和，其中4～10 分为轻度活动，11～19 分为中度活动，≥20 分为重度活动[14]。

1.4 ATF4 表达水平检测

采用蛋白质印迹法检测ATF4 的表达水平。具体步骤：取结直肠镜检查时切除的CD 组织和肠息肉组织，无菌条件下分别在液氮中研磨组织，然后以3 500 r/min 离心15 min，取上层清液，加入蛋白酶抑制剂提取总蛋白；采用10% SDS-PAGE 分离胶电泳，转模后室温封闭1 h；加入一抗（1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；用PBST 清洗3 次，加入二抗（1 ∶5 000），室温下孵育1 h。洗膜后加入ECL显影剂，应用Image J 软件进行灰度分析。

1.5 统计学方法

应用SPSS 19.0 软件进行统计学分析。服从正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t 检验。计数资料以例（%）表示，采用χ2检验。CD 组ATF4 的表达水平与简化CDAI 评分及SES-CD 评分的相关性采用Pearson相关系数法分析。采用ROC 曲线评估ATF4 判断CD 患者预后的价值。采用多因素logistic 回归法分析影响CD 患者预后的因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD 组和对照组的ATF4 表达水平比较

CD 组患者组织中ATF4 的相对表达量为0.74±0.18，低于对照组（1.25±0.20），差异有统计学意义（t＝16.649，P＜0.001）。

2.2 ATF4 与简化CDAI 评分及SES-CD 评分的关系

CD 组患者的简化CDAI 评分、SES-CD 评分分别为（9.17±3.13）分和（12.73±3.84）分。CD 组患者组织中ATF4 的表达水平与简化CDAI 评分及SES-CD 评分均呈负相关（r＝－0.615，P＜0.001； r＝－0.551，P＜0.001）。见图1。

图1 ATF4 与两种评分的相关性散点图 A 简化CDAI评分 B SES-CD 评分

2.3 ATF4 判断CD 患者预后的价值

随访结果显示，75 例CD 患者中32 例（42.67%）预后不良，其中3 例（4.00%）腹腔脓肿，2 例（2.67%）肠梗阻，1 例（1.33%）消化道大出血，3 例（4.00%）肠瘘，23 例（30.67%）接受肠切除手术治疗。根据CD 患者的预后情况将其分为预后不良组（n＝32）和预后良好组（n＝43）。预后不良组ATF4 的相对表达量为0.60±0.09，低于预后良好组（0.84±0.16），差异有统计学意义（t＝8.288，P＜0.001）。ATF4 判断CD 患者预后的ROC 曲线下面积（AUC）、敏感度、特异度、最佳截断值分别为0.902（95%CI：0.812～0.959）、87.50%、86.05%和0.69。见图2。

图2 ATF4 判断CD 患者预后的ROC 曲线

2.4 预后良好组与预后不良组的基本资料比较

两组在性别、年龄、BMI、吸烟史、病变部位、CRP、ESR、1 年内应用免疫抑制剂方面比较，差异均无统计学意义（P 均＞0.05）。预后不良组中肛周病变者、首次治疗应用激素者、疾病行为为穿透型者的占比均高于预后良好组，差异均有统计学意义（P 均＜0.05）。见表1。

2.5 影响CD 患者预后的危险因素分析

将单因素分析结果中可能与CD 患者预后有关的项目，包括肛周病变（无＝0，有＝1）、首次治疗应用激素（否＝0，是＝1）、疾病行为（非狭窄非穿透型/狭窄型＝0，穿透型＝1）、ATF4（≤0.69＝0，＞0.69＝1）作为自变量，将CD 患者的预后情况（预后良好＝0，预后不良＝1）作为因变量，纳入多因素logistic 回归分析，结果显示肛周病变（OR＝ 2.617，95%CI：1.163～7.263，P＝0.013）、 疾 病 行为（ 穿 透 型，OR＝4.828，95%CI：1.842～14.082，P＜0.001）和首次治疗应用激素（OR＝1.638，95% CI：1.105～3.721，P＝0.036）均 是CD 预 后 的 独立 危 险 因 素（P 均＜0.05），ATF4（OR＝0.548，95%CI：0.397～0.733，P＝0.023）是CD 预后的独立保护因素（P＜0.05）。

表1 影响CD 患者预后的单因素分析

3 讨论

内质网应激与CD 的发生及发展关系密切[15]。正常状态下，内质网主要发挥蛋白质加工、合成及转运等功能，当细胞处于缺氧、氧化应激、营养物质缺乏等环境时，未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网腔中聚集，钙离子的储存及释放平衡被打破，导致内质网应激的发生[16]。内质网应激发生后可引起肠上皮细胞中潘氏细胞减少或功能受损，造成由潘氏细胞分泌的防御素、溶菌酶及分泌型免疫球蛋白A 等的水平降低，导致肠道屏障功能减弱，同时使抗原物质易被机体摄取，诱发肠道炎性反应，加重CD 病情[17-19]。ATF4 是参与内质网应激反应的关键物质，可能通过上述机制参与CD 的发生及进展过程[20]。本研究结果显示，CD 组患者组织中ATF4 的表达水平低于对照组，这提示ATF4 可能与CD 的发病有关。

简化CDAI 评分是基于CD 患者的临床症状、体征及并发症等进行评估，SES-CD 评分是通过内镜检查溃疡直径、溃疡面积、炎性病变侵犯肠段面积、肠管狭窄情况等进行评估，可以直观地评估患者的炎性反应状态，两种评分均可在一定程度上反映CD 患者的炎性反应程度。本研究结果显示，CD 患者组织中ATF4 的表达水平与简化CDAI 评分和SESCD 评分均呈负相关，该结果提示ATF4 与CD 患者的炎性反应状态密切相关，可能参与了CD 的病情进展，检测其水平或可评估CD 患者的预后情况。

郝晓炜等[21]的报道指出，CD 患者的预后不良发生率为42.19%。本研究结果显示75 例CD 患者的预后不良发生率为42.67%，与上述结果相近。此外，本研究结果显示预后不良组ATF4 的表达水平低于预后良好组，这提示ATF4 可能与CD 患者的预后有关。ROC 曲线结果显示，ATF4 诊断CD 患者预后的AUC、敏感度和特异度分别为0.902、87.50%和86.05%，这提示ATF4 判断CD 预后的价值较高。

赵甲秀[22]的研究表明，肛周病变、疾病行为是CD 预后不良的独立危险因素。杨荣萍等[23]的研究亦证实肛周病变、疾病行为是CD 预后不良的独立危险因素，此外，该研究还表明初始治疗应用糖皮质激素也是CD 预后不良的危险因素。本研究结果显示，肛周病变、疾病行为（穿透型）和首次治疗应用激素是CD 预后的独立危险因素，与上述文献结果相符。本研究结果还表明，ATF4 是CD 预后的独立保护因素，其原因可能是CD 组织中ATF4的水平可反映内质网应激程度，进而反映CD 预后，关于其病理、生理机制仍有待今后进一步证实。

本研究存在一定不足，如为单中心研究、样本量偏小等，纳入样本难免存在选择偏倚，下一步将开展多中心、大样本研究以验证本文结论。综上所述，ATF4 在CD 组织中低表达，且与CD 患者的炎性反应状态及预后有关。ATF4 在CD 患者组织中的表达水平越低，提示患者发生预后不良的风险越高，检测ATF4 的表达水平有助于判断患者的病情及预后。