老年克罗恩病患者肠组织中lncRNA CCAT1 的 表达与预后的关系

王 娟 解凤妮

克罗恩病（CD）是一种慢性、复发性炎症性肠病（IBD），临床表现为腹痛、腹泻、肠炎和肠梗阻等。CD 的发病原因尚未明确，可能与遗传、微生物和环境因素等导致的胃肠道免疫反应失调密切相关[1]。研究表明，CD 的发病率除了在30 岁左右的青年人群中存在高峰外，在60～80 岁的人群中存在第二高峰[2]。近年来，随着中国人口老龄化问题的加剧，老年CD 患者的数量不断增多。由于临床医师对老年CD 缺乏警惕性，易将其误诊为肠癌、阑尾炎等其他疾病。在临床治疗过程中，CD易反复发作，需要长期监测患者的疾病活动。目前主要的监测方式多为侵入性检查，费用高且耗时，并不适合作为临床常规检查[3]。因此，亟需寻找一种新的、准确度较高的生物标志物。

长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200 个碱基的非蛋白质编码转录本，在功能基因组学中属于一种新型的调控基因。越来越多的证据表明，lncRNA 在细胞生长、发育、分化、凋亡等方面发挥着重要作用。结肠癌相关转录因子1（CCAT1）定位于人类染色体组8q24.21，其最初被证实作为癌基因在结肠癌组织中高表达[4]。近年来研究发现，CCAT1 在其他消化道肿瘤乃至肺腺癌、卵巢癌组织中也呈高表达[5]。Ma 等[6]的研究发现，CCAT1 在炎性组织中表达上调，可通过miR-185-3p/肌球蛋白轻链激酶（MLCK）信号通路促使IBD 发病。本研究拟通过检测CCAT1 在CD 患者炎性组织中的表达水平，分析其与患者预后的关系，以期为CD 患者的临床治疗及预后评估提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入研究的93 对样本[包括炎性组织及炎性组织旁经病理检查证实的正常（非炎性）组织]选自2017 年3 月至2019 年3 月在空军军医大学第一附属医院经肠镜及病理诊断确诊的CD 患者。CD的诊断标准参照《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（2012 年·广州）》[7]。纳入标准：（1）年龄＞60 岁；（2）接受了结直肠镜检查；（3）首次就诊； （4）参与本研究的患者及家属均对本研究知情，并签署了知情同意书。排除标准：（1）合并急性感染性肠病；（2）合并心、肝、肾等重要器官功能障碍； （3）合并自身免疫性疾病；（4）入组前服用了抗炎药物。93 例患者中男性49 例，女性44 例，年龄61～85 岁，平均年龄为（66.28±12.37）岁。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 临床资料收集

收集患者的性别、年龄、体质量指数（BMI）、病变部位（包括末端回肠、回肠、回结肠、上消化道、回结肠＋上消化道）、疾病行为（包括非狭窄非穿透型、狭窄型、穿透型）、有无肛周病变及治疗方案等资料。

1.3 CCAT1 表达水平检测

采用实时荧光定量PCR 法检测CD 患者肠道炎性组织及正常组织中CCAT1 的表达水平。使用TRIzol 试剂提取CD 患者肠道炎性组织和正常组织标本中的总RNA，使用NanoDrop ND-2000 分光光度计测定RNA 的浓度和纯度。使用PrimeScriptTMRT Master Mix 试剂盒将总RNA 反转录成cDNA。使用SYBR®Green PCR 试剂盒进行实时荧光定量PCR。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 个循环。以U6 作为内参，采用2-ΔΔCT法计算CCAT1 的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 随访

参照《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（2012年·广州）》[7]对患者进行常规治疗，在患者出院1周后通过门诊或电话的方式进行为期3 年的随访，每月随访1 次，随访截至2022 年3 月，终点事件为患者死亡。患者在3 年内出现并发症（肠梗阻、肠瘘、腹腔脓肿、肠穿孔、复杂肛瘘、消化道大出血）、行肠切除手术及发生CD 相关死亡等情况时，被认为是预后不良；若患者在就诊后的3 个月内出现上述情况，则不纳入分析。

1.5 统计学方法

应用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用独立样本t 检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用多因素logistic 回归法分析影响患者预后的危险因素。采用ROC 曲线评估CCAT1 判断CD 患者预后的效能。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCAT1 在CD 患者炎性组织及正常组织中的表达

实时荧光定量PCR 检测结果显示，CD 患者炎性组织中CCTA1 的相对表达量为5.21±0.46，显著高于正常组织（1.01±0.09），两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 预后良好组与预后不良组的基本资料比较

根据患者的预后情况将其分为预后良好组（n＝ 52）和预后不良组（n＝41）。两组患者在性别、年龄、BMI 及病变部位方面比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。预后不良组中疾病行为为狭窄型及穿透型者、肛周病变者、首次治疗时使用糖皮质激素者的占比均高于预后良好组，差异均有统计学意义（P 均＜0.05）。见表2。

表2 预后良好组与预后不良组的基本资料比较

2.3 CCAT1 判断CD 患者预后的效能

本研究结果显示，预后不良组的炎性组织中CCAT1 的相对表达量为6.88±0.72，显著高于预后良好组（4.03±0.48），两组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。CD 患者炎性组织中CCAT1 的表达水平判断CD 患者预后的ROC 曲线下面积（AUC）为0.932（95%CI：0.878～0.986），最大约登指数为0.826，最佳截断值为5.33，敏感度为0.902，特异度为0.923。见图1。

图1 CCAT1 判断CD 患者预后的ROC 曲线

2.4 影响CD 患者预后的危险因素分析

将CD 患者的预后情况作为因变量，将单因素分析中可能与CD 患者预后有关的项目（疾病行为、肛周病变、首次治疗时使用糖皮质激素、炎性组织中CCAT1 水平）作为自变量，纳入多因素logistic回归分析模型。结果显示，疾病行为、肛周病变、首次治疗时使用糖皮质激素及炎性组织中CCAT1的水平均为影响CD 患者预后的独立危险因素（P均＜0.05）。

3 讨论

近年来，CD 的发病率在中国呈升高趋势[8]，该疾病高昂的治疗费用给患者的家庭和社会带来了沉重的经济负担。令人遗憾的是，目前尚无能够完全治愈CD 的方法。

表3 影响CD 患者预后的多因素logistic 回归分析

lncRNA 广泛表达于真核细胞中，可参与调控不同水平的基因表达，参与组蛋白修饰、染色体重排、转录激活与干扰等过程。研究表明，lncRNA参与了CD 的发病机制[9-10]。CCAT1 是一种长度为2 628 nt，与基因突变热点区转录因子c-Myc 相连的lncRNA。研究显示，CCAT1 在结肠癌组织中的表达水平显著高于正常结肠黏膜组织，且其异常的高表达能促进结肠癌的发生和发展[11]。IBD 被认为是结直肠癌的癌前病变，结肠上皮的慢性炎性反应可导致结肠癌的发生[12]。非肌肉肌球蛋白Ⅱ（NM Ⅱ）在肠道上皮屏障的调节中起重要作用，抑制其表达可增高肠上皮细胞的细胞旁通透性。NM Ⅱ的激活受到肌球蛋白轻链（MLC）磷酸化的调节，Rho 相关激酶（ROCK）和肌球蛋白轻链激酶（MLCK）参与了这一过程，CCAT1 的过表达可通过激活MLCK 和MLC 磷酸化影响小肠黏膜的屏障功能[6,13-14]。由此推测，CCAT1 可通过上述机制参与IBD 的发生和发展。

本研究通过实时荧光定量PCR 检测发现，CD患者炎性组织中CCAT1 的表达水平显著高于正常组织，且预后不良组的炎性组织中CCAT1 的表达水平显著高于预后良好组，这提示CD 患者炎性组织中CCAT1 的表达水平与预后有关。ROC 曲线分析结果显示，炎性组织中CCAT1 水平预测CD 患者预后的AUC 为0.932，敏感度和特异度分别为0.902 和0.923，这提示CD 患者炎性组织中CCAT1的表达水平判断患者预后情况具有较高的效能。多因素logistic 回归分析结果发现，疾病行为、肛周病变及首次治疗时使用糖皮质激素均为影响CD 患者预后的独立危险因素，这与李珍艳等[15]的研究结果相符；此外，本研究指出炎性组织中CCAT1 的表达水平也是影响CD 患者预后的独立危险因素之一。

综上所述，CD 患者炎性组织中CCAT1 的表达水平越高，提示患者发生预后不良的风险越高，检测炎性组织中CCAT1 的表达水平有助于临床医生判断患者的预后情况。本研究作为一项单中心、小样本量的研究，结果具有一定的局限性。今后，课题组将开展多中心、大样本研究进一步验证本文的结论。