L-天冬氨酸纳米钙促进油菜生长的机理机制

2022-08-02侯佳玉闫磊程锦曾紫君张雅茹鲁克嵩姜存仓

农业环境科学学报 2022年7期

侯佳玉，闫磊，2，程锦，曾紫君，张雅茹，鲁克嵩，姜存仓，3*

（1.华中农业大学资源与环境学院微量元素研究中心，武汉 430070；2.华中农业大学园艺林学学院园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070；3.石河子大学农学院新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室，新疆石河子 832000）

天然或人工生产的纳米材料因其独有的声、光、热、力、电化学性质及比表面积大的特点，被广泛应用于电子、医药、涂料、环境修复、农业等领域。与此同时，纳米材料被释放到土壤中，附着在植物根系表面，进而被吸收、转运、积累在植物各组织中，影响植物的生长发育。近年来研究发现，纳米材料应用到农业上会对种子萌发、幼苗活力、根系生长和光合作用等产生影响，可以通过调控植物体内关键代谢酶活性及相关基因和蛋白的表达，进而提高植物对环境的适应性，而且纳米材料对植物生长产生的影响受其粒径、浓度和作用时间的影响。已有研究表明，适宜浓度纳米材料对植物的生长产生促进作用，而高浓度纳米材料对植物的生长产生抑制作用。纳米二氧化钛会促进油松（）、黑麦草（）、高羊茅（）、苦草[（Lour.）]、黄瓜（L）和杉木[（Lamb.）]的植株生长和种子萌发，相反，当纳米二氧化钛浓度较高时会抑制植物生长。50 mg·L纳米氧化铁会对豇豆[（Linn.）]幼苗生长产生促进作用，而当浓度达到100 mg·L时则会产生抑制作用，并且会在豇豆茎部积累纳米氧化铁。近期有研究指出，高浓度纳米氧化锌会抑制樱桃萝卜（L）、绿豆芽[（L.）]、花叶芦竹（）、黑麦草及玉米（L）植株生长，且其对植株产生的毒害作用随浓度的增加而增强。

钙（Ca）是植物生长所必需的元素之一，在调控植物生长发育和响应环境胁迫方面具有重要的作用，其在植物体内以长距离运输为主，运输能力与蒸腾强度的大小有关，因此老叶部位常有Ca积累，幼嫩部位出现缺Ca现象，严重影响幼叶的生长发育，故及时供应钙肥可以缓解作物缺钙。常见的钙肥有硫酸钙（CaSO）、磷酸一钙[Ca（HPO）·HO]、氯化钙（CaCl）和碳酸钙（CaCO）等。磷酸一钙易转化为磷酸二钙、磷酸三钙，供钙强度较低；氯化钙会造成土壤盐渍化；碳酸钙在酸性土壤中才能发挥良好的补钙作用。因此，螯合钙作为一种新型肥料逐渐受到重视。据报道，叶面喷施螯合钙可以显著提高葡萄（L.）、黄金梨（‘’）、蓝莓（Spp）、苹果（Mill）的产量和品质，提升烤烟（Flue cured Tobacco）烟叶品质，增加烤后烟叶的经济效益。

L-天冬氨酸纳米钙[Ca（L-asp）-NPs]溶解性好、结构稳定、易于吸收，是一种纳米级氨基酸螯合钙，与普通螯合钙相比，对环境风险小且广泛应用于人体钙强化剂，但是它对作物生长的影响以及能否作为新型纳米肥料应用在农业生产中尚需研究。刘亚林等研究发现，施用Ca（L-asp）-NPs会抑制棉花生长，但80 mg·LCa（L-asp）-NPs显著促进枳壳砧木的生长。然而Ca（L-asp）-NPs对油菜生长的影响鲜有研究，因此本研究通过探究不同浓度Ca（L-asp）-NPs对油菜生长及生理特性的效应，明确适宜油菜生长的Ca（L-asp）-NPs浓度，进一步解析其在植物体内的生理机制，为新型纳米肥料应用于生产提供相关依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验于2021年在华中农业大学温室进行，试验材料为“大地199”甘蓝型油菜（）。挑选300颗饱满一致的种子放在铺有一层滤纸的培养皿中，自来水浸泡2 h后倒出，加1/3培养皿的超纯水，用锡箔纸包住盖好的培养皿后在4℃冰箱春化4 h。将春化好的种子放在30℃恒温培养箱中，黑暗条件下培养24 h。待种子发芽后，均匀移在纱布上，用纯水培养。光照培养室温度设定为22℃，光照周期设定为14 h（光照）/10 h（黑暗），光照强度设定为300～320µmol·m·s。待根长至4～5 cm，将长势均匀的幼苗移栽到4 L的黑色塑料盆中培养。

1.2 试验设计

共设6个处理，Ca（L-asp）-NPs分别为NPS-0（0 mg·L）、NPS-25（25 mg·L）、NPS-50（50 mg·L）、NPS-75（75 mg·L）、NPS-100（100 mg·L）以及Ca[1.18 g·LCa（NO）·4HO]，每个处理3次重复，每个重复4株植物。水培方法参考HOAGLAND等配方并略作修改：0.51 g·LKNO，0.49 g·LMgSO·7HO，0.14 g·LKHPO，1.78 mg·LMnCl·4HO，0.07 mg·LCuSO·5HO，0.23 mg·LZnSO·7HO，0.02 mg·LNaMoO·2HO，9.18 mg·LFe-EDTA，1.54 mg·LHBO，所有纳米钙处理的营养液中加入NaNO以保持NO浓度一致。分别用1/4和1/2全营养液培养3 d后，再用全量营养液进行培养，每隔3 d换一次营养液，全量营养液培养4周，植株出现明显差异，进行收获及相关指标的测定。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 植物生长指标的测定

收获时，各处理随机选取3株植物，用直尺测量植株株高和根长。用超纯水冲洗干净后，将植株分为地上部和地下部，称其鲜质量。将植株地上部和地下部放入55℃烘箱中烘干至恒质量，称其干质量。用Epson Perfection V700型根系分析仪扫描根系，利用WinRHIZO系统进行分析，得到总根长（Total root length，TRL），根表面积（Total surface area，TSA），根体积（Total volume，TV），根平均直径（Average diameter，AD），根尖数（Apical number，AN）等指标。

1.3.2 植株Ca含量的测定

用干灰化-原子吸收分光光度法测定油菜根、叶片的Ca含量。即称取0.2 g干燥样品于研钵中充分研磨，电炉碳化后转入马弗炉500℃干灰化4 h，冷却后，加入10 mL 0.1 mol·L的HCl浸提30～60 min，溶解后过滤用原子吸收光谱仪（AAS，AGILENT 204DUO）测定植物中Ca含量。

1.3.3 叶绿素含量及叶片光合参数（气体交换参数）

将新鲜叶片（0.2 g）剪碎后，放入装有25 mL 95%乙醇的比色管（50 mL）中，遮光放置24 h，然后以95%乙醇为空白，分别在665、649、470 nm处测量其吸光度。叶绿素a（）、叶绿素b（）和类胡萝卜素（）含量（mg·L）按下式计算：

在收获当日9：00—11：00，使用便携式光合测定系统（CIRAS-3，USA）测定油菜倒四叶的净光合速率（A）、蒸腾速率（E）、气孔导度（Gs）、胞间CO浓度（Ci）和水分利用率（WUE）。测定时，叶室流速设置为300 mL·min，光强设置为1 200µmol·m·s。

1.3.4 丙二醛（MDA）含量、可溶性蛋白含量测定

新鲜根样品0.5 g用5 mL pH为7.8的50 mmol·L磷酸缓冲液（PBS）在低温条件下研磨，然后在4℃且转速为10 000×条件下离心20 min，过滤后取上清液作为提取物。MDA含量用分光光度计（UV-1800，MAPADA）测量后计算得出。可溶性蛋白用考马斯亮蓝G250染色法测定。

1.4 数据分析

使用SPSS 26.0对数据进行方差分析（ANOVA）。采用Duncan多重比较试验法进行差异显著性检验。用Origin 2020制图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对油菜生长的影响

不同浓度Ca（L-asp）-NPs对油菜生长的影响如图1所示。结果表明，较低浓度的Ca（L-asp）-NPs对油菜的生长影响差异不显著，但是Ca（L-asp）-NPs浓度的升高会促进油菜生长。与NPS-0处理相比，25、50、75 mg·LCa（L-asp）-NPs处理对油菜生长无显著促进作用，100 mg·L的Ca（L-asp）-NPs和1.18 g·LCa显著促进了油菜的生长，其根长分别增加16.74%和7.88%，株高分别增加15.74%和17.43%，但是这两个处理之间油菜长势无明显差异。

图1 不同浓度Ca（L-asp）-NPs对油菜幼苗生长状况的影响Figure 1 Effects of different concentrations of Ca（L-asp）-NPs on rape seedlings growth

2.2 不同处理对油菜植株生物量的影响

随着施用Ca（L-asp）-NPs浓度的不同，油菜植株地下部和地上部的质量存在显著性差异（表1）。NPS-0处理的油菜地下部鲜质量（RFW）、地上部鲜质量（SFW）、总鲜质量（TFW）和地下部干质量（RDW）是最低的，随着Ca（L-asp）-NPs浓度的增加，上述指标呈现增加趋势。与NPS-0相比，NPS-100处理油菜的RFW、SFW、TFW和RDW分别增加了116.05%、31.03%、43.37%和140.00%，Ca处理上述指标分别增加了88.89%、37.32%、44.62%和80.00%；施用100 mg·LCa（L-asp）-NPs的各指标与施用1.18 g·LCa（NO）·4HO无明显差异。不同浓度Ca（L-asp）-NPs对油菜SDW和TDW无显著影响。缺钙条件下，植株的根冠比降低，但是施用不同浓度的Ca（L-asp）-NPs对油菜的根冠比影响不显著。

表1 不同浓度Ca（L-asp）-NPs对油菜幼苗生物量的影响Table 1 Effects of different concentrations of Ca（L-asp）-NPs on seedlings biomass of rape

2.3 不同处理对油菜根系形态指标的影响

总根长（TRL）、总表面积（TRA）、平均直径（AD）、根系总体积（RV）和根尖数（AN）可以反映根系生长状况。结果表明（表2），不同浓度Ca（L-asp）-NPs对油菜根系形态影响不同，TRL、TSA和AN随着浓度的增加而增加，AD随着浓度的增加而减少，RV则在25 mg·LCa（L-asp）-NPs处理时达到最大值，之后随着浓度的增加而降低。与NPS-0处理相比，NPS-25和NPS-50对植株的TRL、TSA、RV和AD无显著影响，NPS-100处理的油菜TRL、TSA和AN分别增加了76.08%、30.78%和1 107.31%，AD和RV降低了25.79%和2.83%；1.18 g·LCa处理的油菜TRL、TSA和AN最大，AD和RV最小。

表2 不同浓度Ca（L-asp）-NPs对油菜幼苗根系形态指标的影响Table 2 Effects of different concentrations of Ca（L-Asp）-NPs on the root morphological characteristics of rape seedlings

2.4 不同处理对油菜根系和叶片中Ca含量的影响

如图2所示，不同浓度Ca（L-asp）-NPs均显著增加根系和叶片中的Ca含量，与不施钙相比，25、50、75 mg·LCa（L-asp）-NPs的油菜根系和叶片中的Ca含量分别增加了35.84%、76.77%、31.92%和92.97%、64.95%、77.47%，其最大值出现在100 mg·LCa（Lasp）-NPs处理，分别增加了59.48%和126.12%，但100 mg·LCa（L-asp）-NPs处理的植株Ca含量显著低于Ca处理，根系和叶片分别降低了55.72%和36.74%。

图2 不同浓度Ca（L-asp）-NPs对油菜幼苗根系和叶片中Ca含量的影响Figure 2 Effects of different concentrations of Ca（L-asp）-NPs on Ca contents in roots and leaves of rape seedlings

2.5 不同处理对油菜叶绿素的影响

如图3所示，油菜叶片叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量和SPAD值随着施用Ca（L-asp）-NPs浓度的增加而增加，较低浓度的Ca（L-asp）-NPs对叶片、、和SPAD值无显著影响，当施用量超过75 mg·L时，、、显著上升，100 mg·LCa（L-asp）-NPs处理的植株叶片叶绿素含量最高。

图3 不同浓度Ca（L-asp）-NPs对油菜叶绿素含量的影响Figure 3 Effects of different concentrations of Ca（L-Asp）-NPs on chlorophyll contents in leaves of rape seedlings

2.6 不同处理对油菜光合参数的影响

对不同浓度Ca（L-asp）-NPs的油菜叶片光合参数进行测定，结果表明（表3），施用Ca（L-asp）-NPs和Ca显著增加了油菜的净光合速率（A）、胞间CO浓度（Ci）、气孔导度（Gs）和蒸腾速率（E），降低了饱和水汽压（VPD）。其中，25、50、75 mg·LCa（L-asp）-NPs处理的植株A、Ci、Gs、E、VPD和WUE差异不显著。与NPS-0处理相比，100 mg·LCa（L-asp）-NPs处理的植株A、Ci、Gs、E显著增加，分别增加了295.31%、31.90%、1 158.03%、376.74%，VPD显著降低48.65%；Ca处理的植株上述指标分别显著增加了367.19%、35.92%、2417.62%、464.29%；VPD显著降低了59.32%。

表3 不同浓度Ca（L-asp）-NPs对油菜光合参数的影响Table 3 Effects of different concentrations of Ca（L-Asp）-NPs on light parameters of rape seedlings

2.7 不同处理对油菜MDA和可溶性蛋白含量的影响

如图4A所示，施用Ca（L-asp）-NPs后，油菜根系的MDA含量增加，而叶片中MDA含量下降。不同浓度Ca（L-asp）-NPs处理的根系MDA含量低于Ca处理，而叶片中MDA含量高于Ca处理。与NPS-0处理相比，100 mg·LCa（L-asp）-NPs处理的油菜叶片MDA含量降低了54.82%，根系MDA含量无显著差异，Ca处理的油菜叶片MDA含量降低了60.05%，根系MDA含量增加了237.80%。

对不同浓度Ca（L-asp）-NPs处理的油菜植株可溶性蛋白含量进行分析（图4B），结果显示，施用Ca（L-asp）-NPs增加了油菜根系和叶片的可溶性蛋白含量，与NPS-0处理相比，在100 mg·LCa（L-asp）-NPs处理的条件下，根系和叶片中可溶性蛋白分别增加了115.39%和62.61%，而在Ca处理条件下分别增加了82.92%和94.46%。

图4 不同浓度Ca（L-asp）-NPs对油菜MDA和可溶性蛋白含量的影响Figure 4 Effects of different concentrations of Ca（L-Asp）-NPs on MDA and soluble protein content of rape seedlings

3 讨论

3.1 不同浓度外源Ca（L-asp）-NPs对油菜生长的影响

纳米粒子通过根系吸收进入植物体内，能促进或抑制植物的生长发育，且纳米粒子对植物的影响与其浓度密切相关。本研究表明，施用较低浓度（25、50 mg·L）的Ca（L-asp）-NPs不会显著促进油菜的生长，而随着浓度的升高，植株株高和根长增加，当浓度达到100 mg·L时，油菜的株高和根长显著增加，促进植株生物量增加，说明施用100 mg·LCa（L-asp）-NPs可以显著促进油菜的生长。TRL、TSA、AD、RV和AN是衡量根系生长的重要指标。近期研究发现，施用不同浓度Ca（L-asp）-NPs会抑制棉花根系生长，显著降低其TRL、TSA和RV等根系形态指标，但低浓度（10、80 mg·L）的Ca（L-asp）-NPs会促进枳壳根系的生长，高浓度（160、320 mg·L）对枳壳幼苗根系产生毒害效应。而本研究发现，油菜根系生长随着Ca（L-asp）-NPs浓度的增加，TRL、TSA、AD和AN逐渐上升，说明纳米材料对植物根系的影响与植物种类及处理浓度有关。根系是植物进行养分吸收的重要器官，其生长情况直接决定植物吸收养分的能力。本研究中，植株根系和叶片中的钙含量随Ca（L-asp）-NPs浓度的升高而升高，说明根系的良

好生长会促进植物对钙元素的吸收与转运；然而Ca（L-asp）-NPs处理的植株根系和叶片的钙含量显著低于Ca处理，原因可能是纳米颗粒小粒径的团聚效果，使其不易穿过细胞壁和细胞膜，使得根系吸收的钙减少，通过韧皮部或木质部向上运输的钙减少，导致叶片中钙减少。

3.2 不同浓度外源Ca（L-asp）-NPs对油菜叶片光合特性的影响

光合作用是植物代谢过程的基础，纳米材料可以改变植物叶片的气孔开放程度、CO消耗状况、蒸腾速率及叶绿素含量，进而对植物的光合作用产生影响。本研究显示，施用Ca（L-asp）-NPs显著增加油菜叶片的Chl a和Chl b含量，进而提高叶片对光能的吸收、传递和转化，激活叶绿体光化学反应；这与GOPINATH等和CAMBROLLE等的研究结果一致，说明Ca（L-asp）-NPs促进油菜幼苗的生长机制可能是其提高了植株叶绿素含量和光合作用。在本研究中，Ca（L-asp）-NPs的施用提高油菜叶片光合参数，其中100 mg·LCa（L-asp）-NPs对叶片光合作用的效果最佳。叶绿素含量和气孔导度是影响叶片光合效率的主要因素。Ca（L-asp）-NPs的施用增加了油菜叶片叶绿素含量，进而提高了光合速率；另外，钙是植物体内的信号分子，作为第二信使参与植物光合作用光合磷酸化和电子传递等重要的生理生化过程，促进叶片对于光能的吸收利用。且Ca（L-asp）-NPs可能参与植物体内碳氮代谢，进而提高光合作用，促进植株生长。

3.3 不同浓度外源Ca（L-asp）-NPs对油菜抗逆性指标的影响

纳米材料会对植物体内的抗逆指标产生不同程度的影响。MDA是细胞膜脂质过氧化的主要产物之一，其含量表示脂质过氧化程度。本研究表明，施用不同浓度Ca（L-asp）-NPs可以提高油菜根系MDA含量，但Ca（L-asp）-NPs处理的植株根系MDA含量显著低于Ca处理，这可能是由于纳米颗粒聚集在细胞壁和细胞膜上，进而对根系膜脂产生不利影响。油菜叶片中MDA含量随着施用浓度的增加而下降，这是因为随着Ca（L-asp）-NPs浓度的增加，叶片叶绿素含量增加，光合作用增强，促进叶片的生长，保护细胞免受过氧化损伤。可溶性蛋白作为渗透调节物质维持细胞内外渗透势的平衡，提高细胞膜的稳定性。植株体内可溶性蛋白含量随着Ca（L-asp）-NPs浓度的增加呈现上升的趋势，说明施用外源Ca（L-asp）-NPs促进植物体内可溶性蛋白含量的增加，为植物生长提供能量和碳骨架，提高植物的抗逆能力[52]。