可见光促进的香豆素类衍生物的绿色仿生催化合成及分光光度法定量分析

张帝，夏天，罗永祥，王兮

湖南大学化学化工学院，长沙 410082

目前本科基础有机化学实验教学内容主要由教科书中经典的有机反应组成，重点操作包含加热回流、趁热过滤、重结晶、薄层色谱、柱色谱、蒸馏等操作。然而有机化学是一门快速发展的学科，近年来有机合成的机理研究和合成技术已有很大进步，但这些新兴的技术在基础实验教学中的推广普及较为滞后，尤其较少涉及光促进的反应。现代有机合成已普遍采用旋转蒸发、核磁共振等手段进行合成和表征，这些方法应当成为化学专业学生的基本技能。本实验从自由基环合反应中获得灵感，将光促进的自由基型香豆素合成方法设计为本科教学实验，增加了光反应、Schlenk技术、流动相技术等操作练习，使本科教学与科技前沿接轨。

1 实验背景

1.1 香豆素合成方法的比较

香豆素是香豆酸的内酯，其衍生物广泛分布在自然界中。香豆素衍生物具有很好的生物活性，大量存在于抗肿瘤、抗菌、抗凝血等药物中[1]。其中，含有香豆素骨架的分子(+)-calanolide A是一种高效的HIV-1逆转录酶抑制剂，已被美国FDA批准进入三期临床实验(图1)。此外，香豆素类化合物还被广泛应用于生物荧光探针领域[2–4]，具有重要的研究价值和广阔的市场前景。

图1 含有香豆素骨架的功能分子

目前已有的香豆素合成方法包括：Perkin反应、Knoevengle反应、Wittig反应、Pechmann反应等(图2)[5]，这些方法在工业合成上得到了应用，但也存在一些局限性，例如：反应条件剧烈、副反应多、官能团兼容性不好等。

图2 香豆素结构的传统合成方法

本方案将前沿的有机合成方法和技术应用到本科实验教学中[6]。反应使用了廉价的起始原料E型肉桂酸和光敏催化剂维生素B2，在405 nm的可见光照射下，利用常压氧气作为氧化剂，反应条件温和，官能团兼容性好，且绿色环保，一定程度弥补了传统合成方法的不足[7–18]。反应涉及《基础有机化学》教材中的烯烃顺反异构等知识点，也包含光促进反应、自由基环化、仿生催化、碳氢键直接官能团化等有机化学前沿知识。

1.2 香豆素类化合物的分析方法

目前香豆素的定量检测方法主要有气相和液相色谱法等，这些方法有检测限低、分辨率高、灵敏度高等优点，但仪器相对比较昂贵。此外，气相色谱法因仪器本身的特点无法适用于高沸点或热稳定性差的香豆素类衍生物的定量分析，液相色谱仪则有仪器本身和HPLC级的溶剂耗材价格相对比较昂贵等特点。基于此，本方案设计了一种操作简单且兼具准确性和高灵敏度的香豆素类化合物的定量分析方法。该方法利用香豆素在碱性条件下与盐酸羟胺反应开环生成苯酚酰基羟胺[9]，进一步与三氯化铁络合生成深红色的配合物，对该配合物使用分光光度法定量分析[10]。

2 实验内容

2.1 实验原理

可见光促进下氧气参与的E型肉桂酸C(sp2)―H键氧化环内酯化反应见图3。可能的反应机理见图4。

图3 反应示意图

第一步为E型肉桂酸的碳碳双键的顺反异构反应形成Z型肉桂酸。在光敏催化剂存在下，可见光促进烯烃双键断开，形成双自由基中间体I1，此时的碳碳单键可以自由旋转，重构碳碳双键形成Z型烯烃。本项目针对反应基于计算化学手段得到R = CH3的E型到Z型烯烃转化的能量差为6.7 kJ·mol-1(图5)，该计算过程可在普通笔记本电脑上完成。

图5 烯烃顺反异构

第二步为经由自由基过程的C(sp2)―H键氧化环内酯化。如图4中机理所示，光敏催化剂维生素B2攫取羧酸的质子形成RFH+和羧酸负离子I2，再被可见光激发到具有强氧化性的激发RFH+*，RFH+*将羧酸单电子氧化成羧基自由基I3时得到RFH*。所得到的羧基自由基发生对芳环的自由基加成，得到中间体I4，I4经由HAT (Hydrogen Atom Transfer)过程得到香豆素最终产物。在HAT过程中RFH*得到氢原子形成RFH2，最后经由氧气氧化回到光敏催化剂的初始状态RF完成催化循环。

本方案中香豆素类衍生物的定量分析是基于香豆素在碱性条件下与盐酸羟胺反应开环再与三氯化铁配位形成有深红色的配合物的反应特性，以及分光光度法对一系列浓度梯度的该配合物作标准曲线，拟合出吸光度与产物浓度的定量关系(图6)。

图6 异羟肟酸铁显色反应

2.2 试剂或材料

实验中所用主要试剂见表1。

表1 化学试剂信息

市售的分析纯甲醇和乙腈含有少量的水、氧气以及杂质，为了使反应有更好的重复性，甲醇和乙腈根据溶剂处理手册重蒸纯化处理[18]。

薄层色谱的高锰酸钾显色剂配制方法：将1.5 g高锰酸钾和5.0 g碳酸氢钠溶解于400 mL水中，搅拌均匀。

三氯化铁溶液配制方法：5 g无水氯化铁，溶解于10 mL浓盐酸，再加入90 mL去离子水稀释。

其他仪器和耗材：移液管(0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL)，容量瓶，磁力搅拌器，聚四氟乙烯搅拌磁子，薄层层析板，薄层层析板专用玻璃缸，称量纸，药匙，量筒，层析柱，毛细管，试管，锥形瓶，磨口圆底烧瓶，试剂瓶，注射器(2 mL)，滴管，乳胶气球等。

2.3 仪器和表征方法

反应在Schlenk体系中进行。1H NMR和13C NMR用JEOL JNM-ECZ400S/L1核磁共振仪测定(400 MHz，室温，溶剂为氘代氯仿)，化学位移基准(δ)由氘代氯仿的参考值给出：δ7.26 (1H NMR)，δ77.16(13C NMR)。405 nm LED光反应器(自制，光宏1.0 W 405 nm LED灯珠20粒，如图7)。TLC显色紫外灯(254 nm，ZF-I型三用紫外分析仪，上海光豪)。旋转蒸发仪(德国海道夫，Hei-VAP Core ML/G3)。紫外-可见光分光光度计(日本岛津，UV-1900I)。

图7 实验装置

2.4 实验步骤与方法

用分析天平称取E型肉桂酸(75.0 mg, 0.500 mmol, 1.0 equiv)，维生素B2 (10.0 mg, 0.0250 mmol,5% (x))，无水硫酸镁(0.300 g, 2.50 mmol, 5.0 equiv)，加入到干燥的Schlenk反应管中。将反应管抽真空，再充入氧气，反复3次，保障反应在氧气氛下进行，然后插上一个常压氧气球。用注射器向Schlenk管中加入无水甲醇(2 mL)和无水乙腈(2 mL)。将Schlenk反应管置入光反应器中，在405 nm可见光照射下通风搅拌6 h，期间用薄层色谱法监测反应进度。反应结束后，过滤除去不溶物，用乙酸乙酯(15 mL)洗涤沉淀，合并滤液和洗涤液，用旋转蒸发仪除去溶剂，柱层析(V石油醚:V乙酸乙酯=8 : 1)得到最终产物(图8)。产物溶解于氘代氯仿，利用核磁氢谱和碳谱表征。

图8 (a) 光促进的反应过程；(b) 旋转蒸发仪移除溶剂；(c) 薄层色谱点板情况(碱性高锰酸钾显色)

配制标准溶液：利用万分之一分析天平称量和100 mL的容量瓶定容，配制香豆素的乙醇标准溶液(0.05 mol·L-1)，盐酸羟胺的乙醇溶液(0.5 mol·L-1)，稀盐酸溶液(1.0 mol·L-1)，氢氧化钾的水溶液(6.0 mol·L-1)，三氯化铁的水溶液(5.0% (w))。本文中标准曲线对应的香豆素乙醇标准溶液配制时的实际称量质量为0.7291 g。

用移液管分别向6支试管中精确加入盐酸羟胺的乙醇溶液(1.000 mL)和氢氧化钾水溶液(0.200 mL)，然后用移液管分别往上述6支试管中精确加入香豆素乙醇标准溶液(0.500 mL，0.600 mL，0.700 mL，0.800 mL，0.900 mL，1.000 mL)，加热至沸腾5 min。冷却后，用移液管加入稀盐酸溶液(2.000 mL)和氯化铁的水溶液(0.300 mL)，后定容至10 mL，振荡摇晃使其均匀。在最佳吸收波长处(450 nm)，先进行空白实验扫描基线，然后分别测量各样品的吸光度值，绘制标准曲线。

配制待测溶液：用容量瓶定容，将产物精确配制成乙醇溶液(10 mL)。

用移液管向测试样品的试管中精确加入盐酸羟胺的乙醇溶液(1.000 mL)和氢氧化钾水溶液(0.200 mL)，然后精确加入待测的香豆素乙醇溶液(1.000 mL)，加热至沸腾约5 min。冷却后，用移液管加入稀盐酸溶液(2.000 mL)和氯化铁的水溶液(0.300 mL)，后定容至10 mL，摇晃均匀。测量其吸光度值，代入标准曲线拟合出的方程，计算待测产物中的香豆素含量。

3 实验结果

3.1 产率

为满足本科实验教学要求，需要将原始文献中所报道的反应规模0.1 mmol放大至0.5 mmol，且保证反应产率和反应重复性以及控制反应时间。本方案中分别从光的辐射强度、温度、催化剂、反应气体氛围、溶剂等方面进行了一系列优化(表2)，经不同实验人员多次重复，反应产率稳定在75% ± 2%，无明显副反应。

表2 反应条件优化

3.2 结构表征结果

测得目标产物的核磁共振氢谱和碳谱(图9)，与已知文献谱图[5]比对，确定其结构。核磁数据如下：

图9 核磁共振氢谱(上)与碳谱(下)

3.3 标准曲线法定量分析结果

对6组不同浓度的样品每组平行测量3次其吸光度，取平均值得到平均吸光度(表3)，进行线性拟合(图10)，线性方程为y= 0.0264x+ 0.0703，相关系数r= 0.999，符合非常好的线性关系。

图10 香豆素含量与吸光度之间的线性关系

表3 异羟肟酸铁在不同浓度下的吸光度

3.4 条件优化思路

自制的405 nm可见光光反应器，使用了双排LED灯珠相对照射，(每个灯珠1 W，20个灯珠，共20 W)，相较于普通台灯反应效率(产率45%)有明显提升，且反应器内装有风扇通风，保证了反应体系温度不会因长时间灯光照射而过热，使体系接近环境温度，且无光泄露污染，完全满足实验教学安全性要求。

反应需要充足的氧气源，对比15 mL的Schlenk管中充入氧气后封管反应，因氧气量不够，导致产率下降。外加常压氧气气球，一方面可以补充氧气源，另一方面可以稳定反应体系内的压力。

3.5 拓展与放大(连续流动相反应，Continuous Flow Synthesis)

本方案中在Schlenk反应管中的反应规模为0.5 mmol，分离收率为78%，可以作为半微量实验应用于本科实验教学中。但如果直接在Schlenk反应瓶中将反应规模放大10倍到5.0 mmol，因为光对溶液的辐射面积和穿透性均有限，造成分离收率急剧下降到25%。本方案利用前沿的连续流动相技术，结合本反应需要光照以及氧气参与等特点，设计了一套简单、廉价、实用的连续流动相的光辐射气体反应装置(图11)。其部件包括：光反应器、石英螺旋管、可控流速的蠕动泵、气球等。将螺旋管置于光反应器内，增大光照面积、提高光辐射效率，蠕动泵可带动封闭体系内溶液循环流动，并增加溶液与氧气的接触。因为有机溶剂持续流动造成体系内压力变化，氧气气球同时也可以起到缓冲作用稳定体系内压力。利用这套装置可将反应规模放大到5.0 mmol，使用10% (x)的光敏催化剂，控制流速为41.5 mL·min-1，反应24 h，以72%的分离收率得到最终目标产物，且无其他副反应，该连续流动相方案可以作为学生实验中的另一种选择方案进行大规模反应尝试。

图11 连续流动相光反应装置示意图

本装置在提高反应实用性的同时，为本科实验教学提供了更多样化的选择，让学生对反应的合成应用和工业生产有了更进一步的认识。反应装置的搭建也让学生从多角度思考影响反应效率的因素，提高学生多方面动手和思维能力，体验化学实验的趣味性。

4 结语

本项目包括有机合成反应，产物纯化和表征，定量分析三个部分。合成反应具有安全高效，条件温和，起始原料廉价易得，无明显副反应，操作简单，环境友好，重复性好等优点。其作为一项本科教学实验项目，可以很好地起到巩固有机化学基础知识和训练有机实验操作的作用，同时多学科交叉，有利于学生对多学科知识的融会贯通。由于剩余原料肉桂酸和香豆素的Rf值相差很大，因此纯化过程简单。利用分光光度法定量分析化合物确定其纯度是本科分析化学教学的重要内容。异羟肟酸铁的显色反应一般被应用于定性鉴定酯类化合物，本方案将该特异性反应结合分光光度法应用于香豆素产物的定量表征。实验操作涉及移液、定容、络合物显色，紫外-可见分光光度计的使用，以及连续流动相光辐射气体反应装置的搭建等一系列操作。

本方案通过学科交叉的综合性实验，对学生的基础知识和实验技能进行了全面系统的训练。既培养学生了解化学前沿知识也注重学生基础知识的巩固。本实验历时约10 h，具有内容涵盖广泛、安全、重复性好等特点，非常适合于本科实验教学[19–21]。可采用分组合作完成实验的模式，提高学生团队精神和协作能力。