宏基因组二代测序诊断赤曲霉所致侵袭性肺曲霉菌病一例报道并文献复习

刘美红，张杰，董畅，刘卓，李艳霞，于丽艳

侵袭性肺曲霉菌病是一种致命的呼吸系统疾病，在免疫缺陷人群中病死率高达40%～90%，其最常见的病原体是黑曲霉、土曲霉、烟曲霉、黄曲霉和构巢曲霉［1］。近年来，随着分子生物学技术的发展，已经有30多种新的曲霉种类被报道可引起侵袭性肺曲霉菌病［2-3］。赤曲霉是一种海洋来源的丝状真菌，属于曲霉菌属，其在37 ℃ M60Y培养基上生长良好，菌落边缘呈灰白色，中间呈棕褐色；反面呈淡黄色至橘黄色。40倍显微镜下，可观察到大量孢子堆和分生孢子；分生孢子呈球状，直径为2～4 μm［4］。赤曲霉在室内环境以及灰尘中被广泛报道［5-6］，除此以外，赤曲霉还在多种植物种子、烟草、食物以及饲料中被检测到［7-10］。关于赤曲霉对人类的致病作用，目前尚未见确切的报道，仅在神经性厌食患者的粪便中发现了赤曲霉［11］；一项研究在两位养牛农民的血清中发现了赤曲霉抗体，同时在一例“农民肺”患者接触的干草中分离出赤曲霉，提示赤曲霉可能会引起呼吸系统疾病［12］。本文报道了1例赤曲霉感染所致侵袭性肺曲霉菌病患者，通其过宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）确诊，这是首次应用mNGS从临床样本中直接检测到赤曲霉，现报道如下。

1 病例简介

患者，男，48岁，主因“反复咳嗽咳痰半年，加重伴咯血1个月”于2021-02-08来大连医科大学附属第一医院呼吸与重症医学科就诊。患者于2020年9月起出现反复咳嗽、咳白色泡沫痰，伴胸闷气促，未系统诊治。2021年1月咳嗽、咳痰加重，伴间断咯血。发病以来无发热，曾口服头孢地尼、阿莫西林克拉维酸钾、阿奇霉素及莫西沙星等抗感染治疗，均未见明显好转。追问病史，患者起病前曾多次出入一所空置多年的废弃楼宇，其内散布多年未打扫的木板、发霉的米、面，灰尘密布。

患者既往体健，入院查体：体温36.7 ℃，脉搏70次/min，呼吸频率18次/min，血压120/70 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。双肺吸气末可闻及湿啰音及干鸣音。实验室检查：红细胞沉降率17 mm/1 h，免疫球蛋白（immune globulin，Ig）E 220 U/ml，血常规检查指标、降钙素原（procalcitonin，PCT）均处于参考范围，G试验、GM试验、曲霉菌抗体均阴性。胸部CT检查显示，双肺上叶及左舌叶周边磨玻璃样密度影（见图1A～1C）。支气管镜检查显示，左上舌叶见血性分泌物，肺泡灌洗液涂片见真菌菌丝，见图2。本例患者既往应用多种抗生素治疗效果不佳，考虑罕见病原体感染可能性大，故取得患者同意后，留取肺泡灌洗液行mNGS。收集5 ml肺泡灌洗液至无菌离心管中，置于-20 ℃冰箱保存。干冰快递至深圳华大基因科技有限公司进行mNGS，主要过程包括核苷酸提取、文库构建、测序和生物信息学分析［13］。取600 μl肺泡灌洗液加入玻璃珠和酶混合震荡后按照TIANamp Micro DNA Kit试剂盒〔DP316，天根生化科技（北京）有限公司〕步骤提取DNA，提取后的DNA被超声破碎成小片段，使用Agilent 2100 Bioanalyzer质控文库插入片段（大小为200～300 bp），使用Qubit dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher Scientific Inc.）质控DNA文库浓度，经环化形成单链环形结构。环化后的文库通过滚环复制生成DNB纳米球，将制备好的DNB纳米球加载到测序芯片，通过BGISEQ-50测序仪进行测序［14］，测序数据下机后去除低质量的序列（长度＜35 bp）以获得高质量的数据，通过BWA（http//bio-bwa.sourceforge.net/）比对将高质量数据中比对上的人参考基因组（hg19）序列去除［15］，剩下的数据在去除低复杂度reads后与PMDB数据库（包括6 350种细菌、4 945种病毒、1 064种真菌、234种寄生虫）进行比对。最后从完整的微生物列表中删除可疑的背景微生物，再根据LANGELIER等［16］研究确定病原学诊断标准，计算微生物相对丰度并依次排序。

图1 患者住院及随访时胸部CT检查结果Figure 1 The chest CT results of patient hospitalized and followed up

图2 患者肺泡灌洗液涂片结果Figure 2 Alveolar lavage fluid smear results of patient

mNGS结果显示，10条序列比对到曲霉菌属，其中5条严格比对到赤曲霉，基因组覆盖率为0.001 6%，见图3。根据mNGS结果调整抗生素为伏立康唑（Pharmacia ＆ Upjohn Company生产，进口药品注册证号H20181102，规格：200 mg）静脉滴注200 mg/次，2次/d，抗真菌治疗，治疗6 d后患者咳嗽、咳痰、咯血、气促症状明显缓解。复查胸部CT检查显示，双肺上叶及左舌叶周边磨玻璃样密度影较前好转，见图1D～1F，患者出院。出院后患者口服伏立康唑片（患者自购）200 mg/次，2次/d，共治疗1个月。3个月后复查胸部CT检查显示，双肺上叶及左舌叶周边磨玻璃样密度影被吸收，见图1G～1I。

图3 患者mNGS结果Figure 3 Metagenomic next-generation sequencing result of patient

2 讨论

本研究以赤曲霉为检索词在中国知网、维普网、万方数据知识服务平台、PubMed等数据库进行检索，未检索到赤曲霉对人类致病的报道。一项多中心研究中，纳入了332株临床标本分离出来的曲霉菌，鉴定发现有一株为赤曲霉［17］，虽然未说明其临床标本类型，但是这一结果提示赤曲霉可能引起人类感染。另一项研究在两位养牛农民的血清中发现了赤曲霉抗体，进一步证实了赤曲霉对人类的致病性；同时该研究还在一例“农民肺”患者接触的干草中分离出赤曲霉，提示赤曲霉可能作为致敏原引起外源性过敏性肺泡炎［12］。

赤曲霉作为曲霉菌的一种，广泛存在于室内环境、灰尘以及发霉的食物中，对人体表现出侵袭性和致敏性两种致病效应。本例患者起病前及起病初期有明确的发霉米面以及室内灰尘接触史，临床症状以咳嗽、咳血痰为主，支气管镜检查显示，左上舌叶见血性分泌物，表现出气管侵袭性；同时本例患者胸部CT检查显示，双肺多发磨玻璃影，亦符合曲霉菌致敏后炎症渗出表现。最后，应用mNGS对肺泡灌洗液中病原菌进行了准确的诊断，最终mNGS显示，5条严格比对到赤曲霉，未发现其他真菌，考虑到真菌细胞壁厚，核酸提取困难，所以虽然比对到赤曲霉的序列数较少也应该考虑其致病可能。单玉璋等［18］曾报道了1例波氏假阿利什霉肺部感染患者，mNGS亦仅检测到5条波氏假阿利什霉序列。LI等［19］报道了1例mNGS仅检测到2条序列的屎肠球菌感染患者，经PCR复核确诊。基于上述研究，即使有些病原体检出序列相对较少，但仍不能放松警惕。除此以外，赤曲霉检出序列数少还可能与标本中病原体本身载量负荷较小以及人源序列比例较高相关。本例患者仅检测到赤曲霉一种真菌，未发现其他类别真菌，根据MIAO等［20］研究中提出的病原体读取标准：mNGS鉴定出一种微生物（物种水平）的覆盖率比其他真菌高5倍即可诊断，所以本例患者赤曲霉感染的可信度较高。遗憾的是，本研究未在肺泡灌洗液和痰液中分离和培养出赤曲霉，这可能与样本中含有赤曲霉的细胞数量较少有关。

本例患者最终依靠mNGS确诊，进一步证实了mNGS在感染性疾病诊断方面的巨大潜力，极大地提高了病原体的检测能力，有助于识别新的病原体［21］。mNGS作为一种新兴的分子生物学技术，可以直接从患者的临床样本中检测所有潜在的病原体，相比于传统的微生物检测技术，mNGS可以快速准确地获取致病微生物信息，受前期抗生素应用的影响很小。有研究表明，mNGS诊断肺部混合感染的灵敏度高于常规检测（97.2%比13.9%）［22］，且mNGS与血培养的诊断符合率达93.7%［23］，在分析免疫缺陷患者时，mNGS检测准确率甚至可能达到100%［24］。由于mNGS对致病微生物的精准分类，很大程度上避免了抗生素的滥用，有助于优化抗生素方案。mNGS还能鉴定出多种难以培养的病原体，包括非结核分枝杆菌、奴卡菌以及各种放线菌［20，25］。与此同时，mNGS也面临着较多问题，包括成本昂贵、结果判读困难等，但在疑难杂症、危重症、免疫缺陷等特殊人群中，mNGS仍具有成为病原体诊断准一线检测手段的潜力，是一种有效的广谱病原体筛查方法［26］。

综上所述，本研究通过mNGS确诊了1例赤曲霉感染所致侵袭性肺曲霉菌病患者，mNGS为本例患者快速明确诊断提供了强有力的技术支持。本例患者让临床医生对致病曲霉菌谱有了新的认识，同时也进一步证实了mNGS在感染性疾病诊断方面的巨大潜力，尤其是对罕见或新发病原体的诊断。

作者贡献：刘美红、于丽艳进行文章的构思与设计；刘美红进行文章的可行性分析，撰写论文；张杰、董畅进行文献、资料的收集与整理；刘卓、李艳霞进行论文的修订；于丽艳负责文章的质量控制及审校，并对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。