红参皂苷Rh2抑制人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞体外嗜神经增殖的研究

王 冠

山西省长治医学院口腔医学系，山西省长治市 046011

涎腺腺样囊性癌(Adenoid cystic carcinoma of salivary gland，ACC)是口腔颌面部最为常见的肿瘤之一，存在嗜神经侵袭特性[1-2]，而这一特性是该肿瘤复发、生存以及预后是否良好的重要因素。许多学者[3]在研究嗜神经侵袭在恶性肿瘤复发的现象中，提出了多因子构成的微环境促使嗜神经侵袭的理论学说。大多数理论认为[3]，存在于神经周围的微环境是适于肿瘤细胞生长和增殖的，嗜神经侵袭不仅造成肿瘤体积增大，其神经分泌的神经生长因子(Nerve growth factors，NGFs)可能通过抑制肿瘤细胞的凋亡，促进了增殖。

红参为五加科人参栽培品的根茎，红参皂苷是从红参根茎浸出液中分离出的微量活性单体，是一种类固醇化合物，其中红参皂苷Rh2在抑制肿瘤增殖与浸润、抗肿瘤转移、促进肿瘤细胞凋亡等方面有一定的作用[4]，而被广泛研究于抗肿瘤领域。人参皂苷Rh3在治疗其他癌症方面的功效已得到广泛证实[5]，而关于红参Rh2在抑制涎腺腺样囊性癌嗜神经侵袭方面却鲜见报道。故而本文就红参皂苷Rh2在抑制人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞体外嗜神经增殖进行研究，以期为口腔临床治疗腺样囊性癌提供理论依据。

1 材料及方法

1.1 材料及试剂 红参皂苷Rh2纯品(北京创联生物技术研究所)，用DOSM溶解，RPMI-1640稀释成所需浓度，0.22μm滤过膜过滤灭菌。ACC-M细胞系(中国科学院上海细胞库)；RPMI-1640培养基(美国Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青生物科技有限公司)；MTT(北京华美生物工程公司)，ELISA检测NGFs试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)。

1.2 主要仪器 CO2孵箱(Thermo，美国)，倒置显微镜(OLYMPUS，日本)，Multiskan Spectrun全波长酶标仪(BIO-TEK,美国)，超净工作台(苏州净化有限公司)。

1.3 细胞培养 将一冻存的ACC-M在37℃水浴箱中复温，解冻，离心，吹打，再置于含10%胎牛血清的RPMI1640的培养液中制成细胞悬液，并放入5%CO2，37℃，100%湿度培养箱中持续培养。

1.4 实验方法

1.4.1 ACC-M单细胞悬液的制备：用0.25%胰蛋白酶进行消化，按1∶3的细胞比例进行传代。观察ACC-M细胞的生长状态，选用对数生长期的细胞，弃去上层培养液，用PBS无菌液冲洗2次，加入0.25%胰蛋白酶，37℃孵箱中消化15min，加入含胎牛血清的培养液，终止其消化，以800r/min离心3min，加入PBS无菌液离心漂洗3次，用含胎牛血清的RPMI1640培养液制成单细胞悬液，细胞计数板调整ACC-M细胞浓度至4×103/ml。

1.4.2 面神经的分离与培养：在显微镜下截取两段各长约2cm SD大鼠面神经，仔细剥离并弃去SD大鼠面神经外膜及其血管，将两段神经纤维分别放置于含10ml的RPMI1640培养液的无菌细胞培养瓶中，备用。

1.4.3 制备面神经培养液：在有面神经的无菌细胞培养瓶中单独培养面神经，其上清液为面神经培养液。48h后用10ml离心管收集，4℃冰箱保存，备用。

1.4.4 红参皂苷Rh2处理细胞并分组培养：第1组为ACC-M对照组，设3列复孔，纵8行，共24孔，接种细胞悬液100μl，使每孔含细胞4 000个，再加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液100μl。第2组为面神经培养液下的ACC-M组，设为实验组1，设3列复孔，纵8行，共24孔，接种细胞悬液100μl，使每孔含细胞4 000个，再加入面神经培养液100μl。第3组红参皂苷Rh2处理面神经培养液下的ACC-M组，设为实验组2，设3列复孔，纵8行，共24孔，接种细胞悬液100μl，使每孔含细胞4 000个，再加入40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml、240μg/ml红参皂苷Rh2 100μl。上述分组分别在96孔培养板中进行，按时间的先后顺序分别接种三板，再将培养板放入5%、37℃、100%湿度孵箱中培养，分别培养24h、48h和72h后，待检测。

1.4.5 MTT法检测ACC-M增殖情况：以24、48、72h时间点为准，实验终止前4h，每孔中加入MTT应用液(5mg/ml)20μl，再次放入5%CO2、37℃、100%湿度孵箱中培养4h。终止培养后，小心吸取孔内培养上清液，每孔加二甲亚砜(DMSO)溶液150μl，震荡10min，以空白对照孔(无细胞)在Multiskan Spectrun全波长酶标仪上调零，测定490nm吸光度值。检测各孔的OD值减去空白对照组OD值即为其实际数值。

1.4.6 ELISA法检测NGFs浓度。用无菌管收集面神经培养液下培养的ACC-M细胞培养液，红参皂苷Rh2处理的面神经培养液下的ACC-M细胞培养液，两液都以2 000～3 000r/min离心20min，4℃冰箱保存，备用。设标准管8管，第1管加标本稀释液900μl，第2～8管加入标本稀释液500μl。在第1管中加入20ng/ml的标准品溶液100μl混匀后用加样器吸出500μl，移至第2管，如此反复做对倍稀释，从第7管中吸出500μl弃去。第8管为空白对照。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100 μl，加样将样品加于酶标板孔底部，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120min。弃去液体，甩干。每孔加检测溶液A工作液 100μl，酶标板加上覆膜, 37℃反应60min。温育60min后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1～2min，大约400μl/孔，甩干。每孔加检测溶液B工作液100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60min。温育60min后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1～2min，350μl/孔，甩干。依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色。依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。OD值可代表培养液当中神经生长因子(NGFs)浓度的大小，随即用全波长酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。

2 结果

2.1 红参皂苷Rh2处理面神经培养液下ACC-M细胞数量与形态学观察 由图1可知，对照组培养的ACC-M细胞形态为单层，稀薄状排列，鹅卵石样镶嵌，胞间稀疏，细胞为多边形，有棱角，边界较清楚，胞浆较丰富，并可见少许处于分裂相的细胞(图1a)； 面神经培养液培养的ACC-M细胞形态呈单层，致密排列，镶嵌融合，细胞间连接较为紧密，细胞为多边形，边界清楚，胞浆非常丰富，并可见多个处于分裂相的细胞(图1b)，说明面神经培养液当中有促进ACC-M细胞生长的因子，也是临床当中腺样囊性癌嗜神经性增殖的分子基础。

a b c

而用红参皂苷Rh2处理面神经培养液下ACC-M细胞生长速度明显减慢，细胞质收缩明显，细胞之间连接疏松，无棱角，胞浆模糊，分裂相减少(图1c)，说明红参皂苷Rh2有抑制ACC-M细胞增殖的作用。由图2可知40～240μg/ml红参皂苷Rh2处理下的ACC-M随着浓度及时间的增加而减少，其抑制率呈现时间与剂量依赖性。

2.2 红参皂苷Rh2对面神经培养液下的ACC-M细胞增殖的影响

2.2.1 由表1可知：与对照组相比，实验组2具有显著性差异(P<0.01)。由表2可知：40～240μg/ml红参皂苷Rh2处理下的ACC-M随着浓度及时间的增加而减少，均有显著性抑制作用，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)；其抑制率呈现时间与剂量依赖性。

表1 各组在不同时间不同培养液作用下ACC-M细胞的OD值

表2 不同浓度的红参皂苷Rh2在不同时间作用于面神经培养液下ACC-M细胞的OD值

2.2.2 MTT法检测实验中所形成的甲臜(Formazan)颗粒可以间接反映细胞的活性，甲臜颗粒越多说明细胞增殖活性愈强，反之则说明细胞增殖活性愈低[6]。与红参Rh2作用的ACC-M细胞所形成的甲臜颗粒较稀疏(见图3)，且随时间变化稀疏程度更为明显。

图3 MTT检测的甲臜颗粒

2.3 不同浓度红参皂苷Rh2对NGFs浓度的影响 由图4可知，在面神经培养液培养下的ACC-M细胞表达的NGFs浓度很高，这种物质也是促进腺样囊性癌嗜神经侵袭的主要物质，将不同浓度的红参皂苷Rh2作用于ACC-M细胞后，NGFs的浓度逐渐下降，其中，与对照组相比，用40～240μg/ml的红参皂苷Rh2处理后的NGFs的浓度显著下降(P<0.05)，尤其是240μg/ml的红参皂苷Rh2抑制作用明显(P<0.01)。

图4 不同浓度红参皂苷Rh2对NGFs浓度的影响

3 讨论

红参皂苷Rh2是由30个碳原子排列成四个环的甾烷类固醇核，是从红参根茎浸出液中分离出的微量活性单体，对癌细胞的生长有抑制作用，逆转肿瘤细胞异常分化，具有抑制癌细胞向其他器官转移，增强机体免疫力，快速恢复体质的作用。对癌细胞具有明显的抗转移作用，与化疗药物联合使用可以起到增效减毒的作用。李帅坪等[7]发现红参皂苷组分对大鼠血浆中神经化学物质有一定的影响；张琴芬等[8]发现红参皂苷体外有抗卵巢癌的作用，证实红参皂苷中的一些成分可以显著降低卵巢癌细胞的增殖并诱导其凋亡。本文通过MTT法表明40～240μg/ml的红参皂苷Rh2对ACC-M细胞嗜神经生长具有明显的抑制作用，在研究ACC-M细胞嗜神经生长和用红参皂苷Rh2处理时间及浓度的相关性实验中，240μg/ml的红参皂苷Rh2对ACC-M细胞嗜神经生长的抑制率最高。表明红参皂苷Rh2具有抑制ACC-M细胞嗜神经生长的作用，暗示其可以作为抑制肿瘤细胞嗜神经生长药物的机制之一，是临床上用于抑制腺样囊性癌嗜神经转移药物的机制之一。

NGFs是一类含量极微却能够促进和维持特异性神经元的生长、存活和分化，影响突触可塑性的可溶性多肽因子[9]。NGFs包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、神经胶质源性神经生长因子(GDNF)、神经营养因子-3(NT-3)、神经营养因子-4(NT-4)等，不同的NGFs对不同部位的神经元发挥作用。NGF有两种功能性受体：一种是高亲和力的酪氨酸蛋白激酶受体TrkA，另一种是低亲和力受体p75。近年来实验证明[10]，NGFs及其受体在多种非神经元性肿瘤细胞的神经侵袭中起着明显的作用。有研究表明[11]涎腺腺样囊性癌中显著高表达NGFs，阳性染色集中在癌细胞的胞浆和间质中，而神经束膜细胞上有大量TrkA存在，由此推测癌细胞分泌的NGFs与神经束膜上的TrkA特异性可能是神经侵袭过程中起“导航”作用的中间媒介。人们在另一种嗜神经侵袭的肿瘤——胰腺癌组织中也发现神经生长因子和TrkA的mRNA表达水平比正常组织增长了2.7倍和5.6倍。神经侵袭的机制中包含着肿瘤细胞与神经组织之间的相互吸引的作用,这种癌细胞与神经组织的特殊亲和力可能是通过NGFs的特异性“吸引”作用来实现的。而本文通过实验得知：红参皂苷Rh2可以降低促使ACC-M细胞增殖的NGFs的浓度。从而推测得出红参皂苷Rh2抑制ACC-M细胞的增殖可能是通过抑制NGFs的活性而实现的。

综上所述，红参皂苷Rh2在体外可以抑制ACC-M细胞的嗜神经增殖，可以为红参皂苷Rh2用于抑制腺样囊性癌嗜神经性生长的临床治疗提供实验依据，对开发新型抗肿瘤药物，新型抗肿瘤转移药物有重要意义，但其中具体机制还需进一步探讨与证明。