幽门螺杆菌检测技术的研究进展*

邓小蝶，李强，陈曦，包郁

610054 成都, 电子科技大学 医学院(邓小蝶);610041 成都,四川省肿瘤医院·研究所,四川省癌症 防治中心,电子科技大学医学院 胸外科(李强),内镜诊治部(陈曦、包郁)

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,HP)在1994年被世界卫生组织定为I类致癌源。而2017年世界卫生组织公布了“12种最危险的耐药细菌”，HP再次位列其中，这表明HP感染是世界范围内的一个重要公共卫生问题。HP与胃黏膜萎缩、肠上皮化生、胃癌以及其他胃恶性肿瘤如胃MALT淋巴瘤息息相关[1]，感染HP是胃癌的最大危险因素，全球大约有75%的胃癌负担和5.5%的恶性肿瘤可归因于HP诱导的炎症和损伤[2]。一项大规模的队列研究显示，根治HP可以有效地降低胃癌的发病率以及死亡率[3]。预计在未来的20～30年中,检测和根除HP仍将是消化系统肿瘤防控的热点，因此如何准确诊断HP感染是有效防控胃癌发生的前提。本文就HP感染诊断相关检测技术的进展做一综述。

1 侵入性检查

1.1 内镜检查

根据《京都胃炎分类》，在普通白光内镜下，感染HP后的胃黏膜主要表现为弥漫性发红、黏膜肿胀、点状发红、皱襞肿大蛇形，而未感染HP的胃黏膜表现为存在清晰、分布规则排列的集合静脉(regular arrangement of collecting venules,RAC)、胃底腺息肉、出血性糜烂、出血点等[4]，由此来判定是否感染HP。随着内镜技术迅速发展，放大内窥镜、色素内镜、内镜窄带成像(narrow band imaging，NBI)、激光共聚焦内窥镜，智能分光比色内镜等新型内镜技术可以清晰观察到胃表面的微细结构，如胃小凹、微血管和细胞形态，为确诊HP感染提供了大量相关信息。

有学者纳入1 897名患者，分别使用普通内窥镜、放大白光内窥镜、放大色素内窥镜来对比三者在预测HP感染的诊断性能，结果显示NBI模式的放大内窥镜可以较为准确地预测HP的感染状态[5]。而相较于传统白光模式，蓝色激光成像中的彩色联动成像模式可以更好地识别弥漫性发红、RAC消失和粘液附着，并据此来评价HP感染[6]。日本学者Nishikawa等[7]将蓝色激光成像观察到的萎缩性黏膜形态分为斑点状、裂纹状和斑驳状，根据这三种模式来诊断是否有HP感染。而激光共聚焦内窥镜能以1 000倍的放大倍数对胃黏膜进行亚表面分析，直接在内镜下观察到聚集生长的HP，成为诊断HP的直接征象[8]。但内镜检查的敏感性和特异性与常规诊断方法相比还有一定差距，而且对内镜医师经验技术要求高，具有局限性，尚不能作为诊断依据；在临床上更多用于为快速尿素酶测试和组织学取材，为行HP检查做准备。

1.2 快速尿素酶试验(rapid urease test,RUT)

RUT需在胃镜检查过程中进行，可通过HP可以产生脲酶这一特性，间接证明HP是否存在。其原理基础是检测胃黏膜内是否存在脲酶，将胃黏膜或者黏液样本添加到试管、凝胶或者其他样本与尿素接触的设备之中，检测尿素水解产物——氨或者二氧化碳。通过观察pH变化来检测HP，简单又可靠，适应范围广。

RUT因试剂廉价、反应速度快、操作方便等优点广泛应用于临床，但其检测结果受到各种因素影响，主要是HP密度的分布,而影响HP密度关键的因素是药物，如质子泵抑制剂(proton pump inhibitor，PPI)、抗生素、铋剂等药物的使用会抑制HP的生长，在测试中引起假阴性反应[9]。PPI已被证实会造成HP感染假阴性的结果，有假设将其归因于“特征的PPI效应”，即PPI促进局部扩张的含氧腺体，扁平或肥大的壁细胞突出到其管腔内，掩盖了胃表面的微生物[10]。为了避免假阴性结果，建议在RUI检查2周前停用PPI，4周前停用抗生素、铋剂等影响HP生长的药物。如上所述，若之前曾进行过根治HP，治疗后HP密度降低，在胃内分布发生改变，易造成检测结果假阴性，因此不推荐使用RUT试验用于根除治疗后HP状态的评估。

1.3 细菌培养

作为检测HP的金标准，细菌培养在我国各级医院并未常规使用，因其培养条件要求高，培养过程繁琐，培养时间长，鉴定手段少。陈彬等[11]总结出一套HP体外培养的最优方案：选用适宜培养基(布氏琼脂、哥伦比亚琼脂或脑心浸液琼脂均可)，加热溶解，在温度下降至40℃～50℃时加入胎牛或羊血清，再加入配制好的1%的抗生素混合液；调节pH为7.5，培养基凝固后，将活检组织经非选择性培养基培养而得到的HP菌液接种，置入含充足CO2的微需氧环境的培养罐或其它密闭装置中，在温度37℃，湿度90%～100%条件下培养72小时左右，即可出现HP菌落。取少量菌落于显微镜下观察，或者行HP生化(脲酶试验、氧化酶试验)、抗原试验鉴定是否培养成功。

繁琐的培养步骤加上培养周期过长导致培养法难以满足临床需求，并且取材需要通过行电子胃镜检查，对于儿童、老年人也不适用。一般而言，细菌培养+药敏试验主要用于个体化治疗。多项研究表明，基于药敏试验的HP根除率要远远高于经验治疗[12-13]。因此，细菌培养主要用于经验治疗失败的难治性HP感染。除此之外，HP培养还可用于科研，如细菌分型和致病性研究、地区耐药性的调查、新药研发等。

1.4 组织学切片和组织化学染色镜检

胃黏膜标本还可以做组织学切片和组织化学染色来检测HP。在显微镜下，HP呈典型的S状或者海鸥状弯曲，主要位于黏膜层表面或胃腺窝部。获得的组织学切片通过染色，根据HP所在部位与染色后的典型形状，据此将其与其他杂菌分开。另外，组织学检查也被认为是直接诊断HP的金标准。

在组织学检测中，染色方法尤为重要，HP常用的染色方法主要包括：HE染色、美蓝染色、Giemsa染色、Warthin-Starry银染色、免疫组化染色等。HE染色方便快捷、廉价，但HP是弱嗜苏木素菌，所以菌体颜色较淡，当HP数量较少时易漏诊。传统Giemsa染色耗时长，有学者通过改良Giemsa染色缩短时间、减少有机化学品的接触，获得了较高的准确性[14]。在免疫组化染色中，HP呈深棕色，细胞核呈蓝色，菌体与背景颜色对比鲜明，阳性极易观察，大大节省了病理医师的阅片时间。但在一般情况下，采用HE染色制剂，再通过仔细地显微镜观察足以鉴定HP感染[15]，免疫组化染色并不推荐常规使用，因为会增加不必要的医疗支出。

2 非侵入性检查

2.1 尿素呼气试验(urea breath test，UBT)

尿素呼气试验是最常用的非侵入性检测HP方法，主要原理是HP可产生相对特异的尿素酶，尿素酶可分解尿素产生NH3和CO2。被检者口服核素(13C或14C)标记的尿素后,若胃内存在HP，则其产生的尿素酶可分解尿素，从而产生核素标记的CO2,CO2弥散入血,经肺呼出。通过收集受试者服药前后(13C-UBT)或仅服药后(14C-UBT)呼出的气体,使用相应仪器检测呼气中核素标记的CO2,就可判断其是否有HP感染。若无HP感染,核素标记的尿素不被分解,则呼气中不含核素标记的CO2。

UBT是临床上最受推荐的非侵入性HP检测方法，简便、快捷、费用低、准确性相对较高。但UBT的准确性同时也受多种因素影响,首先是检测试剂的质量、检测仪器的类型、性能,这些是最为关键的因素；其次是规范的操作(严格的气体收集时间、训练受试者正确收集气体)、仪器校准。UBT检测所需的元素为13C或14C，13C-UBT需用气相质谱仪进行测定，不具有放射性，可以进行定量检测。但气相质谱仪这种贵重、精密的仪器设备很难在基层医院之间普及,佟思羽等[16]通过回顾性研究比较13C尿素呼气试验和14C尿素呼气试验检测HP感染，结果提示两者检出阳性率无明显差异。但13C尿素呼气试验在便捷性和体验度方面优于14C尿素呼气试验，而14C尿素呼气试验成本效益优于13C尿素呼气试验。另外，有研究利用基于13C-UBT的新测试餐，其中含有苹果酸、柠檬酸，这种高浓度的有机酸混合物可以通过降低pH值、延缓胃排空，提高HP的脲酶活性[17]，促进13C-尿素在胃内的弥散分布，增加其在胃内同HP接触的面积和时间，从而提高检测的阳性率。

2.2 基于量子级联激光器(Quantum Cascade Laser，QCL)的呼气检测系统

基于量子级联激光器的呼气检测系统原理与UBT的检测原理相似，被检者同样是通过口服核素标记的尿素,检测患者的呼出气体来确定是否感染HP；目前市场上尿素呼气试验方法所采用的仪器多是红外线能谱分析仪；而量子级联激光器作为一种新型的半导体激光器，相较于红外线能谱分析仪，其具有波长输出范围宽、功能消耗低等优点[18],并且QCL是仅有的可以在室温产生中红外辐射的半导体激光器，基于QCL激光器的系统可以在近室温条件下工作，易于小型化[19]，大大提高了检测HP的便捷性。

基于QCL的检测系统可以通过监测呼出气体来诊断HP。与UBT不同的是，QCL激光器不仅具有良好的灵敏度和选择性，价格也相对低廉。有很多学者应用基于量子级联激光器的仪器来进行气体检测，如二氧化碳[20]。另外，也有学者将量子级联激光器应用于健康儿童、稳定期哮喘儿童、稳定期囊性纤维化患儿呼气分析对比，结果显示，该仪器可以很好地将三者区分[21]，这提示量子级联激光光谱学在研究呼气中挥发物的诊断具有极大潜力。目前基于量子级联激光器的仪器在医学诊断上的使用率正在逐步增加，因其无创、价格低廉，易于推广，在将来的HP检测乃至其他疾病检测或诊断领域或可占有一席之地。

2.3 尿氮排出试验

尿氮排出试验的应用原理与尿素呼气试验相似，被检者口服同位素15N标记的尿素，收集被检者2小时的尿液，利用质谱法检测尿中15N-氨的排出率，以此来判定是否感染HP。这一试验具有无创、无放射性损伤、可做定量分析、反应整体感染情况和克服了活检标本HP分布不均等问题[22]。需要注意一点的是，尿氮代谢物经肝肾代谢，因此，有严重肝肾功不全者慎用。

2.4 粪便抗原试验(stool antigen test，SAT)

HP定植于胃黏膜上皮细胞，随着黏膜上皮更新，含有HP抗原的代谢产物、死亡菌体崩解等作为特异性抗原随着上皮细胞脱落，这些抗原可以抵御消化酶的降解，通过胃肠道随粪便排出。Opekun等[23]进行了一项前瞻性研究来评估粪便抗原试验的检测性能，利用新型粪便抗原试剂盒LIAISON®MeridianH.pylori与传统方法(组织学、培养或快速尿素酶检测)相比较，该试剂盒具有良好的敏感性(95.5%)和特异性(97.6%)；但在Best等[24]的研究结果中，粪便抗原试验的准确性和敏感性并不太乐观，说明SAT的敏感性及特异性存在较大差异，可能是由于不同HP菌株抗原存在差异,因此SAT试剂的准确性在应用前需在当地进行验证后，再推广应用。

粪便抗原检测也不可避免地会受到质子泵抑制剂、抗生素等药物的影响，从而产生假阴性结果[25]。除此之外，粪便标本的质量、标本的运输、粪便的保存条件、以及取样本与处理的间隔时间也会对其结果产生影响[26]，粪便抗原试验的优势主要在于无需口服任何药物，患者接受度高，适用人群范围广。

2.5 血清学检测

血清学检测主要是通过检验HP抗体来确定是否有HP感染,其中包括蛋白芯片法、免疫印迹法、快速胶体金法、酶联免疫吸附试验法和胶乳增强免疫比浊法等。血清学检测不受药物的影响，但血清抗体效价的产生要求抗原持续刺激，因此在早期检测血清学可能会出现假阴性的结果。而根除HP长一段时间内，血清抗体都持续存在，无法区分现症感染和既往感染，也无法评估根除HP后的疗效。

单一血清学检测因无法区分现症感染和过去感染，通常不用于检测HP，但其相较于UBT等检查方法而言，不受药物、溃疡出血、胃萎缩等的影响，而且简便、快速、廉价等优点被广泛用于大范围流行病学调查以及回顾性研究。Butt等[27]通过联合检测HP的VACA、GroEL、HCPC和HP1564四种蛋白，特异性高达90%，敏感性为100%；在HP根除成功的参与者中，6个月后评估VACA、HCPC和HP1564的抗体水平显著降低，该结果提示多重血清学检测对于判定HP活动性感染具有一定优势。

3 分子生物学技术

3.1 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction,PCR)

在1990年，Hoshina等[28]首先将PCR技术应用于HP的诊断。PCR技术可以直接测核酸，检测出微量DNA模板，明显提高了HP诊断的敏感性和特异性。除了检测HP，PCR还能进行菌株亚型鉴定以及HP耐药基因型检测。另外，与传统方法尿素呼气试验、快速尿素酶试验相比，实时荧光定量PCR法在诊断HP准确性上并无差异[29]，还能提供抗HP相关抗生素的耐药性等信息；Peng等[30]的研究表明基于检测胃液的实时PCR在检测HP对克拉霉素的耐药性中，也具有较高的敏感性与特异性。微滴数字PCR法是一种基于油水乳滴生成的直接聚合酶链式反应，单个样本的PCR反应被分成数千个液滴(10,000～100,000个不等)，样本分子在每个单独的液滴中被放大，然后使用荧光检测器对阳性液滴进行检测，提高了对微量标本检测的敏感性；在常规方法诊断为阴性的患者中，微滴数字PCR检测到低密度“隐匿性”HP感染的比例很高(可达36%)[31]。

PCR的检测样本包括活检组织、唾液、粪便[32]，扩大了PCR检测样本的多样性；其用途广泛，包括HP感染的确诊、抗生素耐药性的检测，菌株分型等等[33-34]。但高精密度的仪器、反应所需的试剂、人员的专业性等要求限制了其推广使用。

3.2 环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal nucleic acid amplification technology，LAMP)

LAMP是一种体外等温核酸扩增技术，该技术具有灵敏度高，反应迅速、特异性强等优点。LAMP由2对引物和1种DNA聚合酶组成。在利用粪便样本检测HP感染中，相较于粪便抗原检测、PCR技术，LAMP的诊断性能都要优于前两者[35-36]。有研究者将LAMP的特异性、敏感性、阳性预测值和阴性预测值与常用检测方法(细菌培养、快速尿素酶试验和PCR综合)相比，结果显示，LAMP的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为100%、30.76%、87.67%和100%[37]。与其他分子生物学技术相比，LAMP不需要逆转录、模板变性、在扩增循环过程没有温度变化，基因的扩增和检测可以一步完成，在2个小时之内就可获得结果；而结果的读取也十分便捷，扩增产物在紫外灯或日光下通过肉眼就可判定[38]。但LAMP中6个目标区域和2对引物需要完全覆盖，这导致LAMP的引物设计非常繁琐复杂，并且容易产生非特异性扩增，因此可以对其进行进一步优化引物设计过程，使其引物设计更加便捷精简。

4 其他检测方法

目前有很多新型检测技术正在用于HP感染的检查。有学者[39]就提出了一种使用谷氨酰转肽酶(γ-Glamyl transspeptidase，GGT)激活荧光探针的新方法：γ-谷氨酰羟甲基罗丹明绿色探针与GGT反应，立即产生荧光，利用HP可以产生谷氨酰转肽酶这一特点，使用荧光探针来检测胃活检组织中是否含有HP。它的主要优势是结果快速获得(15分钟)，而灵敏度仍然有限(75%～82%)。因测序成本的降低，现在新一代测序(next-generation sequencing，NGS)可以添加到医疗设备中，以检测HP及其抗生素耐药性，已经有多个学者将NGS用于检测HP感染，在给予根除HP的药物之前，NGS可以快速并且准确地提供HP基因型[40-41]，从而指导临床治疗方案的选择。除此之外，还有一种基于DNA酶的HP比色纸传感器可以用来检测粪便中的HP感染[42]。

5 总 结

诊断HP方法多种多样，各有其优劣势，对这些方法进行评价有助于指导临床选择。评价诊断方法的指标主要包括准确性、便捷性、费用。既往文献报道的各种HP感染检测方法的特点总结于表1[43-44]。

综上所述，侵入性检查以及非侵入性检查都各有其优势与劣势，临床医生可结合患者和当地医院的实际情况，根据不同方法的原理及各自优缺点，选择适宜的检查方法，及时准确地进行检查和治疗，最小程度上减轻患者的心理和经济负担。只有早发现、早治疗，通过降低HP感染率，才能有效地降低胃癌及其他恶性肿瘤的发病率和死亡率。

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