超高效液相色谱-质谱法检测妇舒丸中阿胶特征肽及牛皮源成分*
2022-07-31黄飞燕李晓君张国昌李荣玮黄晓燕
黄飞燕，李晓君，张国昌，李荣玮，黄晓燕**
(1. 滇西科技师范学院，云南 临沧 677000；2. 湖南省药品检验研究院，湖南 长沙 410001；3. 孟定海关综合技术中心，云南 临沧 677000)
目前，市场上驴皮资源紧缺且价格高昂，少数药品企业可能会为了寻求更高的经济效益，出现将牛皮充当阿胶投料或掺伪等不法行为，影响用药安全。为了保证药品的质量及提高检测的专属性，药品监管部门颁布了一系列胶类原料和制剂的检测方法[1-4]。妇舒丸为临床常用含阿胶的中药，处方由当归、川芎、阿胶等23味构成，其质量标准为《中药成方制剂第十二册》[5]。妇舒丸的现行质量标准缺乏对所含胶类的专属性控制指标，按现行标准检验，不能有效控制投料掺伪现象，严重阻碍了其质量控制和市场监管。本研究参照有关文献[6-13]，利用超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)检测技术，建立了阿胶的鉴别和牛皮源限量检测方法，以便管控胶类产品质量和加强市场监管。
1 仪器与试药
1.1 仪器
电子分析天平(METTLER Xse205)；液质联用仪(DIONEX Ultimate 3000-TSQ ENDURA)。
1.2 试药
黄明胶(批号：121695-201802)，阿胶(批号：121274-201904)为中检院提供。胰蛋白酶(质谱纯度)来源Promega 公司，甲酸和乙腈为色谱纯度，试验用的其余试剂采用分析纯。妇舒丸样品为市售获得(厂家1，批号：20190190、20191025、20200810、20201073；厂家2，批号：291025)；阴性样品依照处方自制。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
分析用色谱柱为 UPLC BEH C18(100 mm×φ2.1 mm，1.7 μm)，进样量为5 μL，柱温为35 ℃，以乙腈为流动相A，0.1%甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱(0～6 min、5%→15%A，6～10 min、15%→90%A，10～15 min、90%A，15～20 min、90%→5%A)，流速为0.2 mL/min。
2.2 质谱条件
ESI+离子源，电压为3.5 kV，离子源温度110 ℃，脱溶剂温度为350 ℃，鞘气流速600 L/h，MRM模式。阿胶、牛皮源检测离子分别为m/z539.8(双电荷)→612.4(定量)、923.8，m/z641.3 (双电荷)→726.2(定量)、783.3，碰撞能量分别为16、20 V，要求检测离子MRM峰的信噪比大于3∶1。
2.3 供试品溶液的制备
取妇舒丸样品适量研细，混匀，精密称取粉末约4 g(含阿胶约0.1 g)，置于玻璃烧瓶中，将50 mL碳酸氢铵溶液(1%)准确加入，再称质量，于超声波清洗仪中充分提取30 min，放冷至室温，补足重量损失，摇匀，取上清液适量，用微孔膜(孔径 0.22 μm)过滤，吸取200 μL续滤液，加入20 μL胰蛋白酶溶液(1 μg/μL，临用现配)，混匀，37 ℃恒温水解12 h。
2.4 对照药材溶液的制备
取阿胶粉末0.1 g，自“将50 mL碳酸氢铵溶液(1%)准确加入”起，同供试品方法(2.3)酶解，制成对照药材溶液。
2.5 牛皮源参比溶液的制备
取黄明胶对照药材0.1 g，置于玻璃烧瓶中，将 50 mL 碳酸氢铵溶液(1%)准确加入，再称质量，于超声波清洗仪中充分提取30 min，放冷至室温，补足重量损失，摇匀。再准确量取溶液1 mL，置20 mL量瓶中，用阿胶对照药材溶液稀释至刻度，摇匀，自“取上清液适量”起，同供试品方法(2.3)制备牛皮源参比溶液。
2.6 阴性样品溶液制备
取阴性样品4 g，同供试品处理方法(2.3)制成阴性样品溶液。
2.7 阿胶鉴别的方法学考察
2.7.1 专属性试验
吸取阿胶对照药材溶液、阴性样品溶液与供试品溶液各5 μL，进行测定。结果显示样品中其它药味对阿胶特征肽测定无干扰，方法专属性强，特征例子色谱图如图1所示。
2.7.2 稳定性试验
取制备好的供试品溶液(批号：20201073)，0、6、12、24 h后依方法测定。结果阿胶定量离子峰峰面积值RSD为5.8%，稳定性较好。
2.7.3 重复性试验
取妇舒丸样品(批号：20201073)6份，依法制备并测定所得供试品溶液，结果均呈现与阿胶对照药材色谱相应的峰。
a. m/z 539.8→612.4; b. m/z 539.8→923.8图1 阿胶特征离子色谱图
2.7.4 检出限
将阿胶对照药材逐步稀释，以定量离子峰信噪比为3∶1计算，最低检出质量浓度约为0.01 mg/mL。
2.8 牛皮源成分检查的方法学考察
2.8.1 专属性试验
精密吸取黄明胶参比溶液、阴性对照溶液与供试品溶液各5 μL，进行测定。结果显示样品中其它药味对牛皮源测定无干扰，如图2所示。
2.8.2 线性关系
精密称取黄明胶约0.4 g，准确加入200 mL碳酸氢铵溶液(1%)，称质量，超声提取30 min，放冷至室温，补足重量损失，摇匀。再逐步进行稀释，制得含0.1、0.2、0.4、0.6、1 mg/mL黄明胶的系列溶液(约掺入5%、10%、20%、30%、50%黄明胶)，依法测定。绘制标准工作曲线时，以定量离子峰面积值为纵坐标，黄明胶的掺入量为横坐标，所得回归方程为Y=1.06×105X+ 41586 ,r=0.9953。结果说明在0.1～1 mg/mL范围内，黄明胶掺入量与峰面积成线性关系。
a. m/z 641.3→726.2;b.m/z 641.3→783.3图2 牛皮源特征离子色谱图
2.8.3 精密度试验
连续吸取参比溶液，依法测定6次，牛皮特征肽定量离子峰面积值RSD为1.5%，精密度较好。
2.8.4 稳定性试验
吸取配制好的黄明胶参比溶液，0、6、12、24 h后依法测定。结果牛皮特征肽定量离子峰面积值RSD为2.1%，稳定性较好。
2.8.5 重复性试验
取“2.7.3”项下供试品溶液，依法测定，结果牛皮特征肽定量离子峰面积值RSD为1.5%。
2.8.6 检出限
将参比溶液逐步稀释，以定量离子峰信噪比为3：1计算，最低检出质量浓度约为0.01 mg/mL。
2.9 样品测定结果
依法对妇舒丸样品进行检测，结果在4个样品中检测到阿胶的特征肽，且都含有微量的牛皮源成分，但因样品中相应离子流峰面积低于黄明胶参比溶液相应峰面积，均视为未检出。
3 讨论
3.1 限度的拟定
为排除本方法应用时存在的误判风险，规定本品牛皮源成分检查的限度为5%，即小于或等于5%可判定为不存在牛皮源掺伪，大于5%可判定为存在牛皮源掺伪。
3.2 牛皮源测定结果的判定
由于方法应用过程中使用的测定仪器存在差异，导致样品中的牛皮源成分处于微量水平时可能出现不同的判定结果。为避免上述情况的发生，将样品的检测结果与参比溶液进行比较，从而使不同检测机构的判定尺度保持一致。
3.3 样品质量分析
检测结果显示，样品均检出阿胶且未检出牛皮源，说明本品暂未存在阿胶掺伪投料的情况。
4 结论
本文建立的方法专属性强、灵敏准确，既能有效鉴别阿胶，又能检测牛皮源成分，对于含胶类中成药质量监管的科学性与有效性，保障公众用药安全有效及维护市场公平公正具有积极的推动作用。
