小麦BES1转录因子基因 TaBEH3的克隆及表达分析

姜玉梅，张 京，李巧云，庄季昕，牛吉山

(1.河南农业大学农学院，河南郑州450046；2.国家小麦工程技术研究中心/河南省小麦技术创新中心，河南郑州450046)

BES1(brassinosteroid insensitive 1-EMS-suppressor 1)是一类植物特有的转录因子家族。Yin等利用化学诱变剂甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate，EMS)诱变拟南芥突变体，首次筛选到油菜素内酯(BR)受体抑制因子BES1。基因在调节植物体内BR信号通路中发挥着重要作用。当植物体内BR信号被激活后，基因直接或间接地与其他转录因子结合，调节靶基因的表达，如基因通过调节根尖分生组织发育基因的表达，控制根的发育;基因也可以通过植物茎尖分枝改变植株结构，影响作物产量。除介导BR信号传导外，基因还参与植物体内脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)以及光等信号转导途径，如基因通过抑制基因的表达，使得ABA信号转导受阻，导致苗期发育缓慢;还可以通过调控miR396d的表达水平，调节其靶基因的表达，而基因参与GA合成以及信号传导，控制植株的形态构成。

基因自发现以来，其功能研究主要围绕模式作物拟南芥进行研究。近年来，家族基因在小麦、玉米等农作物中陆续被克隆或鉴定。()作为基因家族中的重要成员，在植物正常生长发育过程中发挥着重要作用。Chen等发现，基因突变可导致拟南芥花药绒毡层细胞的异常发育。Tomoyuki等发现，BEH3作为一个潜在的干细胞调节因子，对维管束细胞的稳定发育具有重要意义。Nguyen等发现，在拟南芥中，可通过泛素化和BR信号转导，在渗透应激反应中发挥重要作用。

本课题组前期已对小麦基因家族成员进行了鉴定和分析，发现基因在小麦根和穗中均具有较高的表达水平。在此基础上，本研究拟克隆基因，并对的3个同源基因的基因结构、系统进化以及时空表达模式进行系统分析，以期为进一步解析基因在小麦生长发育过程中的重要作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试小麦品种为中国春(Chinese Spring)，于2020-2021年度种植于河南省郑州市荥阳市豫龙镇后王村试验基地(34°25′N, 115°39′E)。种植间距和肥水管理按照常规田间管理。取处于雌雄蕊分化期的根、茎、叶、幼穗以及抽穗期的雌蕊和雄蕊，取样后立即置于液氮中保存。

1.2 总RNA的提取以及cDNA的合成

1.3 小麦 TaBEH3基因的生物信息学分析

本课题组前期研究结果显示，小麦基因家族中具有3个典型的组织特异性表达基因(转录本ID分别为TraesCS3A02G139000.1、TraesCS3B02G156600.1、TraesCS3D02G139300.1)，根据蛋白质数据库(https://www.uniprot.org/)的注释信息和基因在染色体上的位置，对3个基因暂命名为、、，从Ensemble Plants数据库(http://plants.ensembl.org/)中获取相应的基因编码区序列和蛋白序列，通过Pfam(http://pfam.xfam.org/)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)共同预测并验证、和基因编码蛋白的保守结构域。用MEGA 7.0软件对普通小麦(L.)以及亲缘关系较近的10个物种的氨基酸序列进行多重序列比对，用邻接法(Neighbor-Joining method)构建系统发育进化树，通过DNAMAN 6.0将序列比对结果可视化。

1.4 小麦 TaBEH3基因的克隆

1.5 小麦 TaBEH3基因的表达模式分析

1.5.1 不同组织的表达模式分析

表1 本研究使用的引物信息

1.5.2 ABA胁迫处理下基因的表达模式分析

选择籽粒饱满的中国春种子，经75%乙醇以及0.2%的次氯酸钠消毒后，将种子铺在装有灭菌滤纸的培养皿中，置于培养箱中进行培养，培养箱参数设置参考文献中的参数。待培养至两叶一心期时，用100 μmol·L的ABA处理，分别在处理后0、4、8、12和24 h取中国春的叶片，提取各处理幼苗的总RNA，反转录为cDNA后进行qRT-PCR，cDNA的合成同1.2，qRT-PCR所用引物以及扩增体系和扩增程序方法同1.5.1。

2 结果与分析

2.1 小麦 TaBEH3基因的克隆结果及序列分析

以中国春幼穗组织的cDNA为模板，利用/B-F/R、-F/R两对引物序列(表1)分别对、、基因进行克隆，其中和所用的引物序列相同。PCR扩增结果(图1)显示，这3个基因均在1 000 bp处得到与预期大小一致的目标条带。将扩增产物回收纯化后连接至pESI-T载体，并转化大肠杆菌DH5α，根据菌落PCR结果，挑选阳性单克隆进行测序，发现、、与TraesCS3A02G139000.1、TraesCS3B02G156600.1、TraesCS3D02G139300.1的编码区序列完全一致。编码区序列比对结果表明，、和均包含2个外显子，和基因的序列相似性为94.68%，和基因的序列相似性为94.15%，和基因的序列相似性为95.73%。

M: DL2000; A: TaBEH3-A; B: TaBEH3-B; D: TaBEH3-D.

2.2 小麦 TaBEH3基因的结构分析

对基因上游2 000 bp的序列进行启动子序列分析，结果(图2)发现，、和的启动子区域含有大量与植物生长发育、激素响应相关的顺式作用元件。其中，生长素响应元件(AuxRR-core)仅存在于基因中，茉莉酸甲酯响应元件(CGTCA-motif)仅存在于和基因中，水杨酸响应元件(TCA-ele-ment)仅存在于和基因中。此外，分生组织表达元件(CAT-box)和脱落酸响应元件(ABRE)在3个基因的启动子序列中普遍存在。推测、和基因对植物的组织分化具有重要作用，且对ABA的响应机制具有极高的相似性。

图2 小麦 TaBEH3基因启动子的顺式作用元件分析

对、和基因编码的蛋白序列进行比对发现(图3)，、和基因分别编码356、354和358个氨基酸，3条蛋白序列之间共存在4个氨基酸差异，且差异氨基酸都存在于C端，TaBEH3蛋白保守结构域的氨基酸序列并未发生任何改变，均含有完整的基因家族结构域。综上所述，基因在小麦进化过程中十分保守。

红色方框为TaBEH3蛋白的保守结构域。

2.3 小麦TaBEH3蛋白的系统进化树分析

利用小麦TaBEH3蛋白与其他物种BEH3蛋白的氨基酸序列构建进化树，结果(图4)表明，13条氨基酸序列聚类成两个大类，其中拟南芥()、粳稻()、玉米()、高粱()和谷子()聚为一类，且TaBEH3蛋白与拟南芥和粳稻BEH3蛋白亲缘关系较远；普通小麦()、乌拉尔图小麦()、二粒小麦()、粗山羊草()、大麦()和二穗短柄草()这几个麦类作物聚为一类，表明TaBEH3蛋白在麦类作物中具有较高的保守性。

图4 小麦TaBEH3蛋白与其同源序列的系统进化树

2.4 小麦 TaBEH3基因的表达模式分析

2.4.1 小麦基因在不同组织中的表达模式

对基因在小麦雌雄蕊分化期的根、茎、叶、幼穗以及抽穗期的雌蕊和雄蕊进行表达模式分析，结果(图5)表明，、和基因在不同组织中的表达模式具有极高的相似性，在各个组织中均有表达，但在不同组织中的表达量有差异。与、和基国在根中的表达量相比，、和基因在抽穗期的雌蕊和雄蕊中均具有较高的表达量，且差异达显著或极显著水平，表明基因在花器官的发育形成过程中具有重要作用；而、和基因在叶和穗中的表达量较低，与在根中的表达量之间差异达显著或极显著水平；、和基因在根和茎中的表达量均无显著差异。

*和**分别表示 TaBEH3-A、 TaBEH3-B和 TaBEH3-D基因的表达量与根组织中的表达量差异达到显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)水平。

2.4.2 小麦基因在ABA胁迫处理下的表达模式

对基因在ABA胁迫处理下的表达模式进行分析，结果(图6)表明，ABA胁迫处理下，、和基因在ABA胁迫处理后的变化趋势具有相似性，均表现为先上升后下降的变化趋势，在胁迫处理12 h时表达量达到最高。基因在胁迫处理8、12和24 h时的表达量显著高于胁迫处理0和4 h时的表达量，和在胁迫处理8和12 h时的表达量显著高于胁迫处理0、4和24 h的表达量。

**表示 TaBEH3基因的表达量与ABA处理0 h相比差异达到极显著水平(P<0.01)。

3 讨 论

目前，已在149种植物中发现了BES1转录因子。普通小麦是典型的具有AABBDD基因组的异源六倍体，其基因组在所有禾本科作物基因组中最为庞大。本课题组前期对小麦基因家族进行鉴定和分析，发掘出3个在小麦生长发育过程中发挥重要作用的基因。本研究根据蛋白质数据库中这3个基因的注释信息和在染色体上的位置暂命名为、和。对、和进行基因结构和表达模式分析发现，3个基因的序列具有高度相似性，且其表达模式也表现出相似性，这与Pfeifer等的研究结果一致。

ABA是植物体内一种重要的内源激素，在植物生长发育和抗逆过程中发挥着重要作用。Jiang等研究发现，基因对BR激素信号调控具有重要作用。本研究发现，、和基因响应ABA激素胁迫，且其响应ABA胁迫的表达模式也高度相似，推测是由于3个基因的启动子区域普遍存在ABA响应元件(ABRE)而导致感知信号能力相似。Zhang等发现，外源ABA与BR的信号转导具有相互作用，BR响应基因/的表达受ABA调控。通过对基因启动子分析发现，启动子区域含有大量与植物生长发育、激素响应相关的顺式作用元件。推测基因直接或间接地参与其他激素在植物体内的稳态调节过程，如生长素和BR在光形态建成过程中共同控制植物生长，而植物生长素调控的转录因子ARF5和基因共同调控与植物生长发育相关基因的表达，进而调节植物生长。此外，基因通过和GA信号负调控因子DELLA蛋白的结合，调控靶基因的表达，从而达到调控细胞伸长的目的。

基因作为基因家族的重要成员之一，目前已被证实其在保证植物正常生长发育和维持植物形态构成过程中发挥着重要作用，但基因在小麦中的研究报道还相对较少，有必要进一步研究基因在小麦生长发育中的作用机理。