羊栖菜多糖对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响及其机制

杨旭东 石 杰 杨骄霞 王桂云 宋高臣 张 杰*

随着生活水平的提高，肥胖的发病率急剧增高，肥胖导致的代谢紊乱进一步引起的冠状动脉粥样硬化性心脏病、糖尿病、动脉粥样硬化、脂代谢紊乱等疾病增多[1]。脂肪组织不仅是重要的能量储存库，也是重要的内分泌器官，因此控制脂肪细胞的数目，抑制脂肪细胞过度分化，诱导脂肪细胞凋亡成为治疗相关疾病的靶点。食用海藻羊栖菜隶属于褐藻门、马尾藻属。羊栖菜多糖（sargassum fusiforme polysaccha- ride,SFPS）是羊栖菜主要成分之一，研究发现SFPS具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗衰老、抗凝血、抗疲劳等作用[2-4]，但SFPS 对脂肪细胞增殖活性的影响及其机制未见报道。本研究就羊栖菜中多糖成分SFPS 对3T3-L1 前脂肪细胞的抑制作用进行分析，并初步探讨其作用机制，为SFPS 进一步应用提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞株：3T3-L1 前脂肪细胞购买于美国ATCC公司，在液氮中保存备用。

药品及试剂：DMEM 高糖培养液、Trizol 和胰蛋白酶购买于美国Gibco 公司，MTT 试剂盒购买于索莱宝有限公司；核苷酸引物购买于上海生工生物技术有限公司；Hoechst33258 试剂盒购买于百浩生物科技有限公司。

仪器：CO2恒温培养箱为德国Thermo 公司，酶标仪为美国Biotek 公司，倒置显微镜为德国Leica公司，凝胶成像系统为美国Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1SFPS的制备用水煮醇沉法提取羊栖菜粗多糖[5]，200 目粉碎羊栖菜，水煮3 次，95%乙醇沉淀，得到深褐色粗多糖，Sevag 法去除蛋白成分，经过SephadexG200 凝胶柱双蒸水洗脱纯化。苯酚-硫酸法测定多糖含量，测得提取的多糖含量为55.13%。

1.2.2 细胞培养根据参考文献[6]，3T3-L1 前脂肪细胞37 ℃ 5% CO2培养于DMEM 高糖培养基（100 mg/L链霉素、100 IU/L 青霉素、10%胎牛血清）。

1.2.3MTT实验对数生长期3T3-L1 前脂肪细胞以2×104/ml 的浓度接种于96 孔板，培养12 h 后，将细胞分为对照组和不同剂量SFPS 组，对照组加入细胞培养液，不同剂量SFPS 组分别加入400、600、800 mg/L 的SFPS 细胞培养液，每组6 个平行孔。继续培养24、48、72 h 后，各组细胞加入5 g/L MTT（10 μl/孔），培养4 h 后，弃上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜（DMSO），轻微振荡15 min，完全溶解结晶物。酶标仪测定490 nm 处光密度值（OD）值，计算细胞相对活力。细胞相对活力（%）＝实验组 OD 值／对照组OD 值×100%。

1.2.4 细胞凋亡率的测定3T3-L1 前脂肪细胞以5×104/ml 的浓度接种于24 孔板，培养24 h 后，每孔加入不同浓度的SFPS，每组6 个复孔，继续培养48 h，各组细胞吸弃培养液，加入固定液4 ℃固定10 min，吸弃固定液，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗2 遍，加入5 mg/L Hoechst 33258 染色液37 ℃染色15 min，吸弃染色液，PBS 冲洗2 遍。荧光显微镜下观察凋亡细胞，荧光标记的凋亡细胞呈蓝色深染。凋亡率（%）=[凋亡细胞/（凋亡细胞+正常细胞）]×100%。

1.2.5 实时荧光定量逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）测定Bcl-2、Bax 和Caspase-3 表达各组细胞分别加入0、400、600、800 mg/L 的SFPS，每组6 个复孔，培养24 h 后，吸弃细胞培养液后清洗细胞，提取细胞RNA。按逆转录试剂盒操作，提取各组RNA 逆转录合成cDNA。PCR 反应条件，95 ℃预变性30 s，进入PCR 循环，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共35 个循环。β-actin 为内参基因，计算Bcl-2/β-actin、Bax/β-actin 和Caspase-3/β-actin 的灰度比值为目的基因mRNA 相对表达量。Bcl-2、Bax 和Caspase-3 的引物序列见表1。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0 统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间差异比较采用方差分析，两两比较采用LSD 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SFPS 对3T3-L1 前脂肪细胞活力的影响

SFPS 分别处理3T3-L1 前脂肪细胞24 h、48 h和72 h 后，MTT 法测定细胞活力。与对照组比较，SFPS 处理3T3-L1 细胞24 h 和48 h，SFPS 600 mg/L组和SFPS 800 mg/L 组细胞活力显著降低，且SFPS 800 mg/L 组细胞活力明显低于其他各组，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，SFPS 处理3T3-L1 前脂肪细胞72 h 后，SFPS 400 mg/L 组、SFPS 600 mg/L 组和SFPS 800 mg/L 组细胞活力显著降低（P＜0.05），且SFPS 800 mg/L 组细胞活力明显低于其他各组（P＜0.05）。见表1。

表1 Bcl-2、Bax 和Caspase-3 的引物序列

表1 SFPS 对3T3-L1 前脂肪细胞活力的影响(n=6,±s)

表1 SFPS 对3T3-L1 前脂肪细胞活力的影响(n=6,±s)

注：与对照组比较，aP＜0.05；与SFPS 400 mg/L 组比较，bP＜0.05；与SFPS 600 mg/L 组比较，cP＜0.05

组别 细胞相对活力(%) 24 h 48 h 72 h 对照组 SFPS 400 mg/L 组 SFPS 600 mg/L 组 SFPS 800 mg/L 组 100.00 98.34±3.51 100.00 97.45±3.07 93.58±4.72ab 86.47±3.94abc 91.76±4.43ab 82.16±3.47abc 100.00 84.10±2.83a 78.75±3.68ab 72.34±2.61abc

2.2 SFPS 对3T3-L1 前脂肪细胞凋亡的影响

不同浓度的SFPS 作用于3T3-L1 前脂肪细胞48 h 后，荧光显微镜下可见蓝色深染体积缩小的凋亡细胞。SFPS 400、600、800 mg/L 组凋亡率分别为2.92%，6.34%，10.27%；对照组细胞凋亡率为1.35%。不同剂量SFPS 组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1～4。

图1 对照组凋亡情况

图2 SFPS 400 mg/L 组凋亡情况

图3 SFPS 600 mg/L 组凋亡情况

图4 SFPS 800 mg/L 组凋亡情况

2.3 SFPS 对各组细胞中Bcl-2、Bax 和Caspase-3 mRNA 表达的影响

与对照组比较，SFPS 400 mg/L 组、SFPS 600 mg/L组和SFPS 800 mg/L 组Bcl-2 mRNA 表达显著降低（P＜0.05），且SFPS 800 mg/L 组的Bcl-2 mRNA 表达明显低于其他各组，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，SFPS 400 mg/L 组、SFPS 600 mg/L组和SFPS 800 mg/L 组Bax 和Caspase-3 mRNA 的表达显著增加（P＜0.05），且SFPS 800 mg/L 组的Bax和Caspase-3 mRNA 表达明显高于其他各组（P＜0.05）。见表2。

表2 SFPS 对各组细胞中Bcl-2、Bax 和Caspase-3 mRNA表达的影响(n=6,±s)

表2 SFPS 对各组细胞中Bcl-2、Bax 和Caspase-3 mRNA表达的影响(n=6,±s)

注：与对照组比较，aP＜0.05；与SFPS 400 mg/L 组比较，bP＜0.05；与SFPS 600 mg/L 组比较，cP＜0.05

组别 Bcl-2/β-actin Bax/β-actin Caspase-3/β-actin对照组 SFPS 400 mg/L 组SFPS 600 mg/L 组SFPS 800 mg/L 组0.58±0.04 0.43±0.05a 0.36±0.03ab 0.21±0.01abc 0.24±0.01 0.12±0.01 0.37±0.03a 0.46±0.03ab 0.27±0.01a 0.36±0.03ab 0.59±0.04abc 0.61±0.05abc

3 讨论

SFPS 是从马尾藻科海藻羊栖菜中提取的水溶性多糖，主要由羊栖菜多糖硫酸酯、褐藻淀粉、褐藻酸和褐藻胶等组成。SFPS 具有抗菌、抑制肿瘤、增强免疫力和降脂等作用，本课题组前期实验也证实SFPS可降低3T3-L1 前脂肪细胞中游离脂肪酸和三酰甘油水平[7]。肥胖、糖脂代谢紊乱及脂肪细胞的过度增殖与一系列慢性疾病密切相关[8-9]。因此，本实验进一步研究SFPS 对3T3-L1 前脂肪细胞增殖的抑制作用，并初步探讨其作用机制。脂肪细胞数量增加是肥胖的原因之一，脂肪细胞数量受细胞凋亡和增殖等多方调控，在其病理生理过程中，细胞凋亡发挥重要的作用。细胞凋亡又称为程序性细胞死亡，是在精密调节下细胞自主有序的死亡过程，是一个主动过程，涉及一系列基因调控。本研究结果显示，与对照组比较，600、800 mg/L SFPS 可显著降低3T3-L1 前脂肪细胞增殖活力，显著升高其凋亡率，表明SFPS 可通过诱导3T3-L1前脂肪细胞凋亡，从而抑制增殖。

真核细胞的凋亡分为内源性、外源性和内质网应激途径，Caspase 蛋白酶家族在此过程中发挥重要作用，活化Caspase 家族，引起级联反应，从而进入凋亡程序。Caspase 家族中的Caspase-3 是激活内外源凋亡通路的启动因子，活化的Caspase-3 激活下游信号转导，启动凋亡。Bcl-2 家族是重要的调控凋亡基因家族，包括促凋亡基因Bax 和抑凋亡基因bcl-2[10]。Bcl-2 与Bax 是一对作用相互拮抗的同源性蛋白调控因子，可共同调控Caspase-3 活性，诱导或抑制细胞凋亡[11-12]。Bax 过表达时，通过同源二聚体Bax/Bax 增多，异源二聚体Bax/Bcl-2 比率上升[13-14]，激活Caspase-3 活性，发挥促凋亡作用，Bax 是活化Caspase-3 的关键蛋白调节因子。抗凋亡基因Bcl-2可抑制Bax 的促凋亡作用，Bcl-2 与Bax 的比率决定其作用，如果异源二聚体Bcl-2/Bax 比率上升，则抑制细胞凋亡。本研究结果显示，与对照组比较，SFPS各剂量组能降低3T3-L1 前脂肪细胞中Bcl-2 的表达量，升高3T3-L1 前脂肪细胞中Bax、Caspase-3 的表达量，提示SFPS 通过改变Bcl-2 和Bax 相对比率，激活Caspase-3，引起级联反应，诱导3T3-L1 前脂肪细胞凋亡。

综上所述，SFPS 能够抑制3T3-L1 前脂肪细胞增殖，诱导其凋亡，并可以明显下调Bcl-2 基因的表达，上调Bax 和Caspase-3 基因的表达。体外实验结果提示，SFPS 抑制3T3-L1 前脂肪细胞增殖的分子机制可能与通过调控Bcl-2、Bax 和Caspase-3 表达，诱导启动细胞凋亡有关，为SFPS 进一步开发提供了理论依据。