老年子宫内膜癌患者组织中环氧合酶2、NF-κB、STAT3表达及意义

梁秀兰 邱红兵 郑玉丹

(邢台市人民医院妇三科第三病区，河北 邢台 054000)

70%～75%的子宫内膜癌发生于绝经后女性，高发年龄为70～79岁〔1〕。临床研究认为年龄是子宫内膜癌预后的独立影响因素，高龄子宫内膜癌患者预后差〔2〕；老年子宫内膜癌患者与中年患者相比，在组织浸润、病理类型、相关标志物水平、肿瘤复发率等方面存在一定差异〔3〕。目前子宫内膜癌的发病机制仍未完全明确，其发生与进展涉及血管生成、细胞增殖与凋亡、免疫炎症反应等多个方面，受多种因素影响〔4〕。近年来随着分子生物技术的快速发展，基因检测逐渐用于恶性肿瘤的诊断、病情评估、预测预后水平，具有较高的临床参考价值〔5〕。本研究旨在探讨老年子宫内膜癌患者组织中环氧合酶2、核转录因子(NF)-κB、转录活化因子(STAT)3表达特点及对病情发展和预后的影响。

1 资料与方法

1.1病例资料 选取2015年1～12月邢台市人民医院收治的老年子宫内膜癌患者160例。入选标准：①年龄≥60岁，住院手术治疗或在门诊行病理活检；②组织病理学检查确诊为子宫内膜癌；③能够正常沟通，完成随访，研究资料完整。排除标准：①合并其他类型恶性肿瘤；②采集标本前有放化疗、激素治疗史者。年龄60～79岁，平均(71.83±4.59)岁。收集同期在本院因子宫良性肿瘤切除子宫的老年患者80例，年龄60～77岁，平均(71.17±5.20)岁。年龄在子宫内膜癌与子宫良性肿瘤患者间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2主要试剂与仪器 兔抗人环氧合酶2单克隆抗体、鼠抗人NF-κB单克隆抗体、鼠抗人STAT3单克隆抗体购于北京博奥森生物有限公司；PV9000二步法免疫组化检测试剂盒购于上海齐一生物有限公司；总RNA提取试剂盒购于北京天根生化科技有限公司。LS-2065石蜡切片机购于深圳达科为生物股份有限公司；IX73倒置显微镜购于日本奥林巴斯株式会社。

1.3免疫组化检测环氧合酶2、NF-κB、STAT3阳性表达情况 使用10%多聚甲醛固定子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织标本，石蜡包埋，4 μm连续切片。PV9000二步法行免疫组化检测，加入兔抗人环氧合酶2单克隆抗体(1∶500稀释)、鼠抗人NF-κB单克隆抗体(1∶800稀释)、鼠抗人STAT3单克隆抗体(1∶800稀释)，操作严格按试剂盒说明书进行。光学显微镜高倍镜下随机选取6个视野拍照，进行阳性细胞计数。根据染色细胞数量和染色强度评分进行评价；染色细胞数量评分：阳性细胞比例<25%计1分、25%～50%计2分、51%～75%计3分、>75%计4分；染色强度评分：无染色计0分、浅黄色计1分、黄色计2分、棕黄色计3分；二者乘积≤2分为阴性，≥3分为阳性。

1.4RT-PCR检测环氧合酶2、NF-κB、STAT3 mRNA表达 总RNA提取试剂盒收集子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织的总RNA，逆转录得到cDNA。PCR扩增引物由上海达为科生物有限公司设计合成。引物序列为环氧合酶2上游：5′-GAAGTCCCCTCTTTAACCGAG-3′，下游：5′-CTTTAGACGGGT-CGTGATGCCA-3′。NF-κB上游：5′-ACGTCATTAGGCGGTCGGAA-3′，下游：5′-CTCATGTAGTAGGTC-GTCGTG-3′。STAT3上游：5′-GCAACGTAGGCTG-GAGTGGA-3′，下游：5′-AGTCTCGTTACGTAGGAC-GTT-3′。β-actin上游：5′-GGTAGTGTTACGGACACCATGCTG-3′，下游引物：5′-G GTGGTACATGGGTCCGTAACG-3′。反应体系20 μl，扩增条件：95℃预变性1 min，95℃变性1 min，50℃复性50 s，共40个循环，72℃延伸2 min。以参照基因β-actin为标准进行相对定量。

1.5Western印迹检测环氧合酶2、NF-κB、STAT3 mRNA蛋白表达 放射免疫沉淀(RIPA)裂解液提取子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织的总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白浓度，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将目标蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜，使用脱脂奶粉封闭液室温下封闭1 h，滴加兔抗人环氧合酶2单克隆抗体(1∶500稀释)、鼠抗人NF-κB单克隆抗体(1∶800稀释)、鼠抗人STAT3单克隆抗体(1∶800稀释)、鼠抗人β-actin单克隆抗体(1∶1 000稀释)，4℃孵培育过夜。滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，1∶2 000稀释，室温静置1 h，电化学发光(ECL)显影，使用Image J软件读取各条带的灰度值。

1.6随访及资料收集 对子宫内膜癌患者进行为期5年的随访，采取电话结合定期门诊复查的形式，记录生存情况。入组时收集子宫内膜癌患者的分化程度、国际妇产科联合会(FIGO)分期、淋巴结转移情况、肌层浸润情况。

1.7统计学分析 采用SPSS23.0软件进行t检验、χ2检验及单因素和多因素Cox回归分析。

2 结 果

2.1不同组织中环氧合酶2、NF-κB、STAT3表达情况 环氧合酶2、NF-κB、STAT3蛋白主要表达于细胞质、细胞核中，阳性表达呈黄色或棕黄色颗粒。子宫内膜癌组织中环氧合酶2、NF-κB、STAT3阳性表达率明显高于正常子宫内膜组织(均P<0.001)。见图1，表1。

2.2不同组织中环氧合酶2、NF-κB、STAT3 mRNA和蛋白表达水平比较 子宫内膜癌组织中环氧合酶2、NF-κB、STAT3 mRNA和蛋白表达水平明显高于正常子宫内膜组织(均P<0.001)。见表2。

图1 不同组织中环氧合酶2、NF-κB、STAT3蛋白表达(免疫组化染色，×200)

表1 不同组织中环氧合酶2、NF-κB、STAT3阳性表达水平比较〔n(%)〕

2.3老年子宫内膜癌患者环氧合酶2、NF-κB、STAT3表达与临床病理参数的关系 环氧合酶2、NF-κB、STAT3表达水平在不同分化程度、FIGO分期、淋巴结转移、肌层浸润的老年子宫内膜癌患者之间差异有统计学意义(P<0.01)；其中中低分化、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、肌层浸润≥1/2的环氧合酶2、NF-κB、STAT3表达水平明显偏高。见表3。

2.4不同环氧合酶2、NF-κB、STAT3表达情况患者生存时间比较 环氧合酶2、NF-κB、STAT3阳性表达者生存时间〔(26.84±4.97)、(28.05±4.36)、(25.69±5.24)个月〕短于阴性表达者〔(47.52±3.04)、(48.81±3.59)、(50.37±2.71)个月〕，差异有统计学意义(t=25.189、27.053、30.697，均P=0.000)。

2.5老年子宫内膜癌患者预后影响因素的单因素分析 单因素Cox回归分析显示，分化程度、FIGO分期、淋巴结转移、肌层浸润、环氧合酶2、NF-κB、STAT3是老年子宫内膜癌患者预后的影响因素(P<0.05)。见表4。

表2 不同组织中环氧合酶2、NF-κB、STAT3 mRNA和蛋白表达水平比较

表3 老年子宫内膜癌患者环氧合酶2、NF-κB、STAT3表达与临床病理参数的关系〔n(%)〕

表4 老年子宫内膜癌患者预后影响因素的单因素分析

2.6老年子宫内膜癌患者预后的多因素Cox回归分析 将单因素分析中分化程度、FIGO分期、淋巴结转移、肌层浸润、环氧合酶2、NF-κB、STAT3进一步纳入多因素Cox回归分析模型，结果显示，FIGO分期、淋巴结转移、肌层浸润、环氧合酶2、NF-κB、STAT3是老年子宫内膜癌患者预后的独立影响因素(P<0.05)。见表5。

表5 老年子宫内膜癌患者预后的Cox多因素分析

3 讨 论

环氧合酶2是前列腺合成中的关键酶，可通过调节前列腺素的合成来影响机体的病理生理过程〔6〕。环氧合酶2基因属于诱导表达蛋白，正常生理状态下人体组织细胞中低表达或不表达，当受到刺激后出现诱导性表达〔7〕。本研究结果提示环氧合酶2参与子宫内膜癌的发生与发展，其过表达促进肿瘤发展的可能原因为，促进肿瘤细胞增殖、迁移和转移，抑制细胞凋亡，诱发肿瘤微环境的免疫抑制并刺激新生血管形成〔8〕。NF-κB是人体细胞中的重要转录因子，介导机体免疫、应激反应、细胞凋亡、细胞增殖等过程，具有多种功能〔9〕。相关研究显示，NF-κB能够诱发肿瘤的发生、侵袭、转移等过程，在肝细胞癌、肺癌等多种恶性肿瘤组织中均存在NF-κB持续激活〔10，11〕。目前研究认为NF-κB引发肿瘤的机制包括：①通过对细胞周期素D1的调控来诱发细胞不受控制的无限增殖〔12〕；②通过激活凋亡抑制基因，合成抗凋亡因子，激活原癌基因等机制来抑制细胞凋亡信号传导，减慢细胞凋亡速率〔13〕。本研究结果提示NF-κB参与子宫内膜癌的发生与进展，在其中发挥重要作用。

STAT3是近年来被广泛研究的转录因子，参与机体正常细胞的增殖、分化和新生血管生成和调控免疫活动〔14〕。当STAT3异常活化后能够介导细胞增殖、转移、侵袭和凋亡等过程，在肿瘤新生血管形成、免疫逃逸等过程中发挥重要作用〔15〕。相关研究显示，胶质瘤组织中STAT3表达水平明显高于正常脑组织，其在高级别脑胶质瘤组织中的表达水平明显高于低级别胶质瘤组织〔16〕。本研究结果提示STAT3能够作为一项反映子宫内膜癌生物学行为的重要指标，用于临床诊断和预后评估。对子宫内膜癌患者进行为期5年的随访，结果显示，环氧合酶2、NF-κB、STAT3可作为预测患者预后的参考指标。研究发现，肿瘤淋巴结转移和侵袭性与子宫内膜癌患者术后生存时间明显相关〔17〕，本研究中FIGO分期、淋巴结转移、肌层浸润能够间接反映出子宫内膜癌转移和侵袭能力，影响患者生存时间。

综上，环氧合酶2、NF-κB、STAT3阳性的子宫内膜癌患者生存时间较短，可能与肿瘤分化程度较低、分期较高、肌层浸润程度高、淋巴结转移比例高有关，可作为子宫内膜癌患者肿瘤侵袭性和预后评估的参考指标。