Box-Behnken 响应面法结合多指标综合评分法优化龙眼叶提取工艺Δ

黄光强，郑飘雪，梁 洁，2，3，4，5#a，陈奎奎，曹玉嫔，胡 珏，安施佳，梁晶春，刘星晨，朱晓峰（.广西中医药大学药学院，南宁 530200；2.广西壮瑶药工程技术研究中心，南宁 530200；3.广西优势中成药与民族药开发工程技术研究中心，南宁 530200；4.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心华南分中心，南宁 530200；5.暨南大学中医学院，广州 50632）

龙眼叶为无患子科龙眼属植物龙眼Dimocarpus longanLour.的叶或嫩芽，味甘淡、性平，具有解表清热、解毒利湿等功效[1]。龙眼叶作为广西民间常用中药，分布广泛且资源丰富。有研究表明，龙眼叶具有降血糖、抗氧化等作用[2－4]。本课题组前期证实，龙眼叶主要含有没食子酸、原儿茶酸、没食子酸乙酯、山柰酚、木犀草素、槲皮素、槲皮苷和紫云英苷等成分[5－6]。其中，没食子酸乙酯、槲皮素、木犀草素和山柰酚可通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性，而发挥降血糖的作用[5]；没食子酸和原儿茶酸等酚酸类成分具有抗氧化活性[7－9]。这表明龙眼叶的活性成分为黄酮类和酚酸类成分。虽然本课题组前期已测定了龙眼叶中黄酮类成分的含量，但指标成分主要为槲皮素、木犀草素、山柰酚等成分[10]，单一指标并不能系统全面地反映龙眼叶的质量。因此以黄酮类和酚酸类成分作为考核指标，可以对龙眼叶提取工艺进行更全面的评价。

Box-Behnken响应面法能直观反映各影响因素之间的交互关系，可对多因素、多水平结果进行分析，具有实验次数相对较少、检测精确度高等优点[11]；同时其可通过对各因素的显著性及相互作用进行分析，确定工艺条件的最佳组合[12]。目前，有关龙眼叶提取工艺的研究较少，主要为龙眼叶中总黄酮的提取工艺研究[13－14]。基于此，在前期研究的基础上[15]，本研究采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法同时测定了龙眼叶中没食子酸、原儿茶酸、没食子酸乙酯、槲皮素、木犀草素和山柰酚的含量；同时以乙醇体积分数、料液比、提取时间为考察因素，上述6种成分含量的综合评分为考察指标，采用Box-Behnken 响应面法优化龙眼叶的提取工艺，旨在为龙眼叶的综合评价及资源开发提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有LC 2030 型Plus HPLC 仪（日本Shimadzu 公司），SQP 型万分之一电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]，XMTD-7000型电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司），DZG-303A 型超纯水仪（重庆颐洋企业发展有限公司），H1650-W型离心机（长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司）等。

1.2 主要药品与试剂

没食子酸对照品（批号RP1911126，纯度99.99%）、原儿茶酸对照品（批号RP190605，纯度99.99%）、没食子酸乙酯对照品（批号RP200120，纯度99.85%）、槲皮素对照品（批号RP200602，纯度99.25%）、木犀草素对照品（批号RP191106，纯度98.66%）、山柰酚对照品（批号RP200312，纯度99.83%）均购自成都麦德生科技有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

8 批龙眼叶药材（编号S1～S8）于2019 年11 月采集于广西不同产地，经广西中医药大学药学院滕建北教授鉴定为无患子科植物龙眼D.longanLour.的叶。8 批龙眼叶药材来源信息见表1。

表1 8批龙眼叶药材来源信息

2 方法与结果

2.1 没食子酸等成分的含量测定

2.1.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取没食子酸、原儿茶酸、没食子酸乙酯、槲皮素、木犀草素和山柰酚对照品适量，用甲醇溶解并定容，制成上述各成分质量浓度分别为204.00、17.46、21.30、235.40、6.30、65.70µg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取龙眼叶药材粉末2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入乙醇-盐酸（体积比为9∶1，下同）16 mL[3]，称定质量，水浴提取90 min，放冷，再次称定质量，用乙醇-盐酸补足减失的质量，于13 000 r/min离心10 min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 色谱条件 以InertSustain C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～14 min，10%A→26%A；14～26 min，26%A→28%A；26～38 min，28%A→40%A；38～54 min，40%A→75%A）；检测波长为280 nm（没食子酸、原儿茶酸、没食子酸乙酯）、360 nm（槲皮素、木犀草素、山柰酚）；流速为1.0 mL/min；柱温为35 ℃；进样量为5 μL。

2.1.4 系统适用性试验 取上述混合对照品溶液、供试品溶液、空白对照溶液（甲醇）适量，按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。由图1 可知，各色谱峰的分离度均大于1.5，理论板数均不低于5 000，空白对照溶液不干扰测定。

图1 6种成分的混合对照品溶液、供试品溶液、空白对照溶液的HPLC图

2.1.5 线性关系考察 分别精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液1、2、4、6、8、10µL，按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以各待测成分的进样量为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归。结果见表2。

表2 6种成分的回归方程与线性范围

2.1.6 精密度试验 取“2.1.1”项下混合对照品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果显示，没食子酸、原儿茶酸、没食子酸乙酯、槲皮素、木犀草素和山柰酚峰面积的RSD 分别为0.10%、0.27%、0.52%、0.16%、0.32%、0.11%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 取“2.1.2”项下供试品溶液（编号S1），分别于室温下放置0、2、4、8、10、12、24 h 时按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，没食子酸、原儿茶酸、没食子酸乙酯、槲皮素、木犀草素和山柰酚峰面积的RSD 分别为0.35%、1.01%、1.86%、0.15%、0.97%、0.11%（n＝7），表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。

2.1.8 重复性试验 取龙眼叶药材（编号S1），共6 份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按外标法计算样品含量。结果显示，没食子酸、原儿茶酸、没食子酸乙酯、槲皮素、木犀草素和山柰酚含量的RSD 分别为1.77%、1.62%、2.29%、1.50%、1.26%、1.23%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.1.9 加样回收率试验 取已知含量的龙眼叶药材（编号S1），每份约1 g，共6 份，精密称定，分别精密加入没食子酸对照品1.452 0 mg、原儿茶酸对照品0.162 8 mg、没食子酸乙酯对照品0.188 6 mg、槲皮素对照品1.764 0 mg、木犀草素对照品0.050 0 mg和山柰酚对照品0.455 8 mg，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.3”项下色谱条件进样测定并计算加样回收率。结果见表3。

表3 6种成分的加样回收率试验结果（n＝6）

2.2 没食子酸等成分的提取方法选择

取龙眼叶药材（编号S1）2 g，精密称定，加入乙醇-盐酸10 mL，分别考察不同提取方法（水浴提取法、超声提取法和回流提取法）对没食子酸等6 种成分含量的影响。结果显示，超声提取法中没食子酸等6种成分的总含量低于水浴提取法和回流提取法结果，且水浴提取法中没食子酸、槲皮素的含量较高，其他成分的含量相差不大，综合考虑选择水浴提取法。结果见表4。

2.3 综合评分计算公式的确定

根据表4 结果，按含量高低分别赋予各指标成分权重系数。水浴提取法中没食子酸等6种成分的总含量为5.002 0 mg/g，其中没食子酸、原儿茶酸、没食子酸乙酯、槲皮素、木犀草素和山柰酚的含量分别占总含量的30.10%、3.22%、21.24%、35.12%、1.72%、8.61%，因此将权重系数设置4个梯度：没食子酸和槲皮素的含量较高，权重系数设置为30%；没食子酸乙酯的含量居中，权重系数设置为20%；山柰酚的含量其次，权重系数设置为10%；原儿茶酸和木犀草素的含量最低，权重系数设置为5%。据此得到实际综合评分（Y）＝ΣDiJ×权重系数[16－17]，即Y＝DiJ没食子酸×30%×100+DiJ原儿茶酸×5%×100+DiJ没食子酸乙酯×20%×100+DiJ槲皮素×30%×100+DiJ木犀草素×5%×100+DiJ山柰酚×10%×100[17]，式中DiJ 表示某指标的含量。

表4 不同提取方法对6 种成分含量的影响（n＝3，mg/g）

2.4 单因素实验

2.4.1 乙醇体积分数 取龙眼叶药材（编号S1），每份约2 g，共7 份，精密称定，分别加入不同体积分数的乙醇（50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇）各10 mL，于80 ℃水浴提取50 min，考察不同乙醇体积分数对综合评分的影响。结果显示，当乙醇体积分数为100%（无水乙醇）时，综合评分最高，故选择乙醇体积分数为80%～100%进行后续实验。结果见图2A。

图2 乙醇体积分数等因素对综合评分的影响

2.4.2 料液比 取龙眼叶药材（编号S1），每份约2 g，共7份，精密称定，分别按不同料液比（1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10，g/mL）加入无水乙醇，于80 ℃水浴提取50 min，考察不同料液比对综合评分的影响。结果显示，当料液比为1∶7时，综合评分最高，故选择料液比为1∶4～1∶10进行后续实验。结果见图2B。

2.4.3 提取温度 取龙眼叶药材（编号S1），每份约2 g，共7 份，精密称定，加入无水乙醇14 mL，于不同水浴提取温度（40、50、60、70、75、80、90 ℃）提取50 min，考察不同水浴提取温度对综合评分的影响。结果显示，虽然提取温度为90 ℃时的综合评分最高，但与80 ℃时的综合评分相差不大。从节约能源考虑，故选择提取温度为80 ℃。结果见图2C。

2.4.4 提取时间 取龙眼叶药材（编号S1），每份约2 g，共7份，精密称定，加入无水乙醇14 mL，于80 ℃水浴分别提取不同时间（30、50、70、90、110、130、150 min），考察不同提取时间对综合评分的影响。结果显示，当提取时间为70 min 时，综合评分最高，故选择提取时间为50～90 min进行后续实验。结果见图2D。

2.5 Box-Behnken响应面法优化龙眼叶的提取工艺

2.5.1 实验设计与结果 根据Box-Behnken 响应面法的设计原理[18]及单因素实验结果，以乙醇体积分数（A）、料液比（B）、提取时间（C）为考察因素，以综合评分（Y）为考察指标对龙眼叶的提取工艺进行优化。Box-Behnken响应面法优化龙眼叶提取工艺的因素与水平见表5，实验设计方案与结果见表6。

表5 Box-Behnken响应面法优化龙眼叶提取工艺的因素与水平

表6 Box-Behnken响应面法优化龙眼叶提取工艺的实验设计方案与结果

2.5.2 模型建立与方差分析 采用Design-expert 8.0.6软件对表6中的数据进行多元回归拟合，得二次多项回归方程为Y＝73.07+11.82×A+11.72×B+4.79×C－1.22×AB+1.39×AC－2.33×BC+5.03×A2－12.20×B2+1.59×C2。方差分析结果显示，所建模型有显著性差异（P＜0.01），表明该模型的可信度较高；模型的失拟项无显著性差异（P＞0.05），表明可以用此模型进行分析和预测。决定系数（R2）为0.996 6，表明该模型拟合度较好，实验的误差较小。因素A、B、C、BC、A2、B2、C2的影响显著（P＜0.05），因素AB、AC的影响不显著（P＞0.05）。结果见表7。

表7 Box-Behnken响应面法优化龙眼叶提取工艺回归模型的方差分析结果

2.5.3 各因素交互作用 利用Design-expert 8.0.6 软件绘制各因素的响应面图。当固定其中某一因素时，可以分析其余任意2个因素交互作用对综合评分的影响，响应面的曲面越陡峭，表示因素交互作用越明显[18]。结果显示，因素B与因素C的交互作用显著，因素A与因素B、因素A与因素C的交互作用均不显著。结果见图3。

图3 各因素交互作用对综合评分的响应面图

2.5.4 最优提取工艺的确定及验证 利用Designexpert 8.0.6 软件得到龙眼叶的最优提取工艺为A3B2C3，即乙醇体积分数100%，料液比1∶7（g/mL），提取时间90 min，提取温度80 ℃。在此最优提取工艺条件下进行3次实验验证（以编号S1样品验证）。结果显示，没食子酸、原儿茶酸、没食子酸乙酯、槲皮素、木犀草素和山柰酚的平均含量分别为1.493 6、0.084 4、0.291 7、2.061 6、0.048 7、0.518 0 mg/g，平均综合评分为97.54 分（RSD＝0.33%，n＝3），与预测综合评分（99.05分）的相对误差为1.55%，表明优化所得工艺稳定、可行。结果见表8。

表8 最优提取工艺的实验验证结果（n＝3）

2.5.5 样品含量测定 取8批龙眼叶药材粗粉约2 g，精密称定，按最优提取工艺制备供试品溶液，再按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按外标法计算样品含量。每样品平行测定3次。结果见表9。

表9 8 批龙眼叶药材中6 种成分的含量测定结果（n＝3，mg/g）

3 讨论

参考相关文献及本课题组前期研究发现，没食子酸、原儿茶酸、没食子酸乙酯在280 nm波长处有较强的紫外吸收，且干扰较少；槲皮素、木犀草素、山柰酚在360 nm 波长处吸收较强[15，19]，故本研究采用双波长切换法（280 nm 波长处测定没食子酸、原儿茶酸和没食子酸乙酯，360 nm波长处测定槲皮素、木犀草素和山柰酚）同时测定龙眼叶中没食子酸等6种成分的含量。

本研究结果显示，采用超声提取法时，没食子酸等6种成分的总含量低于回流提取法和水浴提取法；进一步对比回流提取法和水浴提取法后发现，采用水浴提取法时，没食子酸、槲皮素的含量较高，其他4种成分的含量相差不大。同时，考虑到回流提取法的装置复杂且操作繁琐，故选择水浴提取法。此外，本研究还考察了甲醇、乙醇、甲醇-盐酸、乙醇-盐酸等不同提取溶剂对没食子酸等6 种成分含量及色谱图的影响，结果发现，以乙醇-盐酸为提取溶剂时，没食子酸等6种成分均能完全出峰且色谱图基线平稳，干扰较小，故选择乙醇-盐酸为提取溶剂。

本研究得到的龙眼叶最优提取工艺为乙醇体积分数100%，料液比1∶7（g/mL），提取时间90 min，提取温度80 ℃。经验证，没食子酸等6种成分的平均综合评分为97.54 分，与预测综合评分（99.05 分）的相对误差为1.55%；表明所得提取工艺稳定、可行，可用于龙眼叶提取工艺的优化。

综上所述，Box-Behnken 响应面法结合多指标综合评分法可用于龙眼叶的提取工艺优化，且所得最优提取工艺稳定、可行。