血清miR-124-3p、TLR4水平在慢性阻塞性肺疾病患者中表达变化及临床意义*

李欣欣,蒋彩花

山东省公共卫生临床中心：1.检验科；2.汉光微生物实验室，山东济南 250101

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特征是持续性气流阻塞，COPD是全世界发病率和病死率最高的疾病之一，在全球疾病经济负担中排名第5[1-2]。诱发COPD的因素较多，如呼吸道感染、吸烟、空气污染等，但其发病机制尚不清晰。慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)患者出现病情恶化，如呼吸困难、痰量增加和痰脓胀等症状，AECOPD患者症状发作频率增加，肺功能加速下降，生活质量严重受损，同时病死率也明显增加[3]。临床上目前尚无治愈COPD的方法，但可通过多种疗法缓解患者症状、减轻并发症发生风险，提高患者生活质量[4]。研究发现，持续性异常炎性反应可促进COPD的疾病进展[5]。微小RNA(miRNA)是非编码内源性小RNA，可通调节靶基因的表达调控生物体中多种基本生命过程。miRNA-124-3p(miR-124-3p)是一种炎症相关miRNA，在多种炎症疾病中发挥重要作用，但其是否参与COPD的炎症过程尚不清楚[6]。Toll样受体4(TLR4)是天然免疫受体，可通过TLR4/核因子活化B细胞κ轻链增强子(NF-κB)信号通路影响多种炎症因子的表达，参与COPD患者的固有免疫反应[7]。本研究观察COPD患者血清miR-124-3p、TLR4水平变化，并分析其与患者肺功能、预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2018年3月至2019年12月收治的77例COPD患者作为研究对象，纳入标准：(1)均符合《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版)》[8]；(2)年龄40～75岁；(3)临床资料完整。排除标准：(1)妊娠期、哺乳期女性；(2)合并其他肺部疾病；(3)合并恶性肿瘤；(4)合并免疫系统疾病。根据文献[8]将COPD患者分为稳定期32例(稳定期组)和AECOPD患者45例(AECOPD组)。选取本院收治的单纯呼吸道感染者38例作为感染组。另选取同期在本院体检的健康者42例作为对照组，4组年龄、体重指数及性别比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)，稳定期组病程与AECOPD组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。本研究已通过医院伦理委员会批准。

表1 4组一般资料比较

1.2方法

1.2.1样本采集及保存 采集COPD患者入院后第2日清晨空腹肘静脉血5 mL，对照组于体检当天、感染组于就诊当日采集空腹肘静脉血5 mL，3 500 r/min离心10 min，收集上层血清保存于-20 ℃冰箱中待测。

1.2.2qRT-PCR法检测血清miR-124-3p相对表达水平 取出血清样本，采用RNA提取试剂盒[货号：DP419，天根生化科技(北京)有限公司]提取样本中的总RNA，检测其纯度、完整度，将满足要求的RNA逆转录为cDNA，根据逆转录试剂盒(货号：205313，德国QIAGEN公司)说明操作，以所得cDNA为模板进行qRT-PCR法，采用2-ΔΔCt法计算miR-124-3p相对表达水平。miR-124-3p及内参U6的引物序列见表2。

表2 miR-124-3p及内参U6的引物序列

1.2.3血清TLR4水平检测 取出血清样本，采用酶联免疫吸附试验法检测血清TLR4水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.4一般指标检测 记录各组受试对象的年龄、性别、体重指数等资料。采用肺功能仪检测用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼气容积(FEV1)，并计算FEV1/FVC。

1.3随访 AECOPD组患者出院后进行为期1年的随访，统计其预后情况。预后不良：AECOPD组患者病情进展，再入院或死亡；预后良好：AECOPD组患者病情得到有效控制。

2 结 果

2.14组血清miR-124-3p、TLR4水平比较 感染组、稳定期组、AECOPD组血清miR-124-3p相对表达水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。稳定期组、AECOPD组血清miR-124-3p相对表达水平低于感染组，血清TLR4水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；AECOPD组血清miR-124-3p相对表达水平低于稳定期组，AECOPD组血清TLR4水平高于稳定期组及感染组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 4组血清miR-124-3p、TLR4水平比较

2.24组肺功能指标水平比较 感染组FEV1/FVC低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；感染组FEV1、FVC与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；稳定期组、AECOPD组FEV1、FVC及FEV1/FVC均低于对照组、感染组，差异有统计学意义(P<0.05)；AECOPD组FEV1、FVC及FEV1/FVC均低于稳定期组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 4组肺功能指标水平比较

2.3AECOPD组血清miR-124-3p、TLR4水平与肺功能指标的相关性分析 AECOPD组血清miR-124-3p相对表达水平与FEV1、FVC及FEV1/FVC呈正相关(P<0.05)，血清TLR4水平与FEV1、FVC及FEV1/FVC呈负相关(P<0.05)，血清miR-124-3p与TLR4呈负相关(P<0.05)。见表5。

表5 AECOPD组血清miR-124-3p、TLR4水平与肺功能指标的相关性分析

2.4AECOPD组不同预后患者血清miR-124-3p、TLR4水平比较 AECOPD组随访1年后，预后不良者共20例，预后良好者25例。预后不良者血清miR-124-3p相对表达水平低于预后良好者，血清TLR4水平高于预后良好者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 AECOPD组不同预后患者血清miR-124-3p、TLR4水平比较

2.5血清miR-124-3p、TLR4水平对AECOPD组预后不良的预测价值 血清miR-124-3p、TLR4水平预测AECOPD组预后不良的曲线下面积分别为0.822、0.707，截断值分别为0.55、3.36 ng/mL，灵敏度分别为85.0%、90.0%，特异度分别为80.0%、52.0%；二者联合检测预测AECOPD组预后不良的曲线下面积为0.854，灵敏度为85.0%，特异度为76.0%。见图1。

图1 血清miR-124-3p、TLR4水平预测AECOPD组预后不良的ROC曲线

3 讨 论

COPD现已被公认为是一种异质性疾病，这种临床异质性由生物学异质性体现，研究生物标志物可能有助于开发针对COPD的新疗法，并有助于提出更为有效的治疗决策[9]。COPD患者存在持续性的慢性炎症及进行性气流受限，这是造成气道和肺部结构永久改变的原因[10]。其中气道炎性反应是COPD发病过程的关键因素之一，因此本研究通过探讨炎症相关因子miR-124-3p、TLR4在COPD患者血清中的表达及意义，期望寻找到特异性生物标志物，为提高COPD患者临床疗效提供帮助。

越来越多的研究表明，miR-124-3p在多种人类癌症中起抑癌作用，包括乳腺癌、胰腺导管腺癌、肝细胞癌和膀胱癌等，miR-124-3p可抑制癌细胞增殖和转移并促进细胞凋亡[11]。此外，越来越多的证据表明miR-124-3p在炎症中起着重要的调节作用。研究发现，通过脂多糖(LPS)诱导RAW264.7巨噬细胞模拟肝缺血/再灌注损伤的炎症状态，此时上调miR-124-3p相对表达水平可抑制炎性反应，改善肝损伤[12]。另有研究显示，miR-124-3p模拟物能有效抑制LPS诱导的白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子分泌及巨噬细胞mRNA表达，miR-124-3p高表达能够减弱严重社区获得性肺炎患者的炎性反应，可能是通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶和NF-κB信号通路而发挥作用[13]。本研究结果显示，血清miR-124-3p相对表达水平由高到低分别为对照组、感染组、稳定期组、AECOPD组，差异有统计学意义(P<0.05)，且AECOPD组血清miR-124-3p相对表达水平与肺功能指标呈正相关，提示miR-124-3p可能参与COPD患者的疾病进展。

TLR4是参与脂质识别的膜相关受体，其主要配体是LPS/内毒素，革兰阴性细菌细胞壁的主要成分。TLR4可诱导促炎性细胞因子释放，TLR4信号传导途径涉及多种调节炎性反应的关键转录因子，包括NF-κB，信号转导子和转录激活因子转录因子家族(STAT1)、激活蛋白1(AP1)等[14]。TLR4在COPD炎症过程的免疫调节中起重要作用，参与局部和全身炎症、病情发展及对T辅助免疫反应的调节，TLR4信号通路的过度激活可能促进COPD的进展[15]。赵静等[16]研究发现，COPD患者外周血及肺组织中TLR4呈高表达，且随着病情加重而增加，与肺功能指标呈负相关。本研究中，感染组血清TLR4水平高于对照组，FEV1及FVC低于对照组，但差异均无统计学意义(P>0.05)，FEV1/FVC显著低于对照组，感染组肺功能有所下降，TLR4水平无特异性变化；稳定期组、AECOPD组患者血清TLR4水平高于对照组，AECOPD组血清TLR4水平高于稳定期组及感染组，且AECOPD患者血清TLR4水平与FEV1、FVC、FEV1/FVC呈负相关，与文献[16]报道结果一致，提示TLR4在AECOPD患者中特异性表达，其可能通过调节COPD患者的炎症过程参与COPD的疾病进展。

SU等[17]通过双荧光素酶实验发现miR-124-3p对TLR4有靶向调控作用。在病毒性肺炎小鼠中过表达miR-124-3p可降低TLR4及NF κB p65的表达，miR-124-3p可能通过靶向TLR4阻断NF κB通路抑制炎性反应[6]。本研究中，AECOPD患者血清miR-124-3p与TLR4呈负相关，二者共同作用参与COPD的发生发展。本研究还发现，AECOPD组预后不良者血清miR-124-3p水平低于预后良好者，血清TLR4水平高于预后良好者，血清miR-124-3p、TLR4水平预测AECOPD组预后不良的曲线下面积分别为0.822、0.707，二者均对AECOPD患者预后有一定的预测价值，但二者联合检测预测价值更高，提示检测miR-124-3p、TLR4水平可预估患者预后，对于所预测的预后不良患者尽早采取治疗，或可改善患者预后，提高患者生活质量。

综上所述，COPD患者血清miR-124-3p呈低表达，TLR4水平呈高表达，二者水平与COPD患者疾病严重程度及肺功能有关，并可预测AECOPD患者预后情况。但本研究中样本量较少，miR-124-3p、TLR4对AECOPD患者预后的预测能否广泛应用于临床中仍需大样本数据支持。