黑米酶解工艺关键技术的实验研究

2022-07-29曲亮璠郝景雯谢庆方许勤虎王祥河

天津科技 2022年7期

曲亮璠，郝景雯，谢庆方，黄华，许勤虎，王祥河

(1. 天津市工业微生物研究所有限公司天津 300462；2. 天津量信检验认证技术有限公司天津 300462；3. 天津实发中科百奥工业生物技术有限公司天津 300462；4. 天津市工业微生物企业重点实验室天津 300462；5. 天津市工业微生物工程技术中心天津 300462)

黑米是我国著名珍贵稻种，资源广泛，历史悠久，极具特色。明代李时珍在《本草纲目》中记载，黑米具有“滋阴补肾、健脾暖肝、明目活血”等功效。黑米中蛋白质含量比普通白米高出 25%，VA、VB、VC、锌、铁、钙、磷、铜、锰等维生素和矿物元素也十分丰富[1-2]。除此之外，黑米的皮层中还含有很多高效的功能性物质，如皂苷、生物碱、甾醇、多酚、黄酮、花青素等，能够起到抗炎、抗过敏、抗氧化、改善微循环、提高机体免疫功能、清除自由基、改变体内酶活性和预防衰老的作用[3-5]。

目前深加工及高附加值谷物产品的开发尚处于起步阶段，谷物经糊化、液化、糖化、灭酶、冷却后添加乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等食用真菌进行单一或复合发酵，再经调配可制备具有创新特色谷物发酵饮料，市场前景良好[6-8]。酶法糖化黑米的反应过程环境友好，副反应少，反应条件较为温和。辛泓均[9]以葡萄糖当量(DE)为指标优化小米糖化酶解工艺制备小米低醇饮料，得到的最佳酶解参数为酶解温度50℃、酶解时间 60min、加酶量 184U/g，此时 DE值为 63.3%。李伟等[10]以 DE值为指标，通过正交优化试验确定了富硒发芽糙米的最适反应条件为酶添加量35μg/mL、酶解反应时长60min、反应温度85℃。卫晓英等[11]优化了薏米水解工艺，即在温度 50℃、pH6.0、α-淀粉酶添加量 200U/g条件下水解 3h，还原糖的含量最高为1.73%。

本实验采用双酶法对黑米进行了酶解处理，以还原糖为指标优化了黑米糖化工艺，后续可通过生物技术研发谷物类发酵饮料，为黑米的综合利用及其产品的工业化生产奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：市售黑米。

试剂：葡萄糖淀粉酶(酶活力≥200000U/g)；α-淀粉酶(酶活力≥20000U/g)；硫酸铜、亚甲蓝、酒石酸钾钠、乙酸锌、氢氧化钠、亚铁氰化钾、冰乙酸、盐酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

METTLER AE200分析天平；德国米技米技炉；METTLER Seven Multi pH计；上海博迅 GZX-9146MBE数字鼓风干燥箱；上海沪西定时恒温磁力搅拌器90-2型；力辰恒温水浴锅HH-8。

1.3 实验方法

1.3.1 工艺流程

黑米→清洗→烘干→粉碎→过筛→糊化→糖化→灭酶。

黑米清洗3次后于70℃下烘干、粉碎，过40目细筛，去除大颗粒物。将黑米细粉与蒸馏水按照质量比 1∶15的比例90℃糊化20min，调节温度和 pH，添加 α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶进行糖化，100℃煮沸3min灭酶。

1.3.2 还原糖含量测定方法

参照 GB 5009.7—2016中直接滴定法测定黑米糖化液中还原糖的含量[12]。

1.3.3 酶解反应单因素实验

黑米糊化后，分别调节酶制剂添加量(0.2%、0.4% 、0.6% 、0.8%、1.0%)、酶解 pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)、葡萄糖淀粉酶与 α-淀粉酶比例(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)、酶解时间(1、2、3、4h)、酶解温度(50、55、60、65℃)进行单因素实验，测定酶解液中还原糖含量，筛选较优反应条件。

1.3.4 酶解工艺正交实验

在上述单因素实验结果的基础上，以酶解液中的还原糖为指标，采用四因素三水平的正交实验优化酶解工艺，正交因素与水平见表1。

表1 正交实验因素与水平设计Tab.1 Orthogonal experimental factors and horizontal design

2 实验结果

2.1 酶制剂添加量优化

酶制剂添加量对黑米糖化液中还原糖含量的影响如图 1所示。当葡萄糖淀粉酶和 α-淀粉酶总添加量从0.2%增加至1.0%时，酶解液中还原糖含量分别为 2.15、3.91、4.06、4.18、4.23g/100g，呈上升趋势。当酶制剂添加量超过0.6%时，还原糖上升趋势渐缓，最终接近平衡。此时底物含量成为反应过程中的决定性因素，持续增加酶添加量不能明显提升酶促反应效果。综合考虑实验结果和经济因素，将反应酶制剂的较适宜添加量定为0.6%。

2.2 酶解时间优化

酶解时间对黑米糖化液中还原糖含量的影响如图 2所示。当葡萄糖淀粉酶和 α-淀粉酶的作用时间从 1h延长至 4h，黑米糖化液中的还原糖的含量分别为 2.64、4.08、4.11、4.16g/100g。在反应初始时期，随着底物与葡萄糖淀粉酶和 α-淀粉酶相互作用时间的延长，水解程度不断提高，酶解持续进行 2h以后目标产物浓度的变化不再明显。这可能是由于在黑米糖化反应初期体系中淀粉含量较高，底物与酶活性位点可以充分结合；在反应后期随着液化酶、糖化酶酶活下降，以及受到已生成的葡萄糖底物浓度抑制等因素的影响，黑米糖化液中还原糖的含量不再有明显的变化[13]。因此，将酶解反应的时间应定为2h。

图2 酶解时间对黑米糖化液中还原糖含量的影响Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on reducing sugar content in black rice saccharification soluion

2.3 葡萄糖淀粉酶与α-淀粉酶添加比例优化

葡萄糖淀粉酶与 α-淀粉酶添加比例对黑米糖化液中还原糖含量的影响如图3所示。在黑米的酶解过程中，黑米淀粉受到了内切型 α-淀粉酶和外切型葡萄糖淀粉酶的作用。由于 2种淀粉酶的作用及功能特性并不相同，故二者的添加比例对底物的酶解速度有很大影响。葡萄糖淀粉酶和 α-淀粉酶比例分别为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，还原糖含量分别为3.43、4.15、4.01、3.65、3.22g/100g。α-淀粉酶为液化酶，可与黑米淀粉分子中的 α-1，4-糖苷键随机结合，并产生同样数量的还原端和非还原端。葡萄糖淀粉酶为糖化酶，只能与黑米淀粉分子的非还原尾端结合，并对其进行剪切。α-淀粉酶的水解作用可增加葡萄糖淀粉酶底物的摩尔浓度，二者有协同作用。由实验结果可知，2种淀粉酶水解黑米的较适宜添加比例为 2∶1。

图3 葡萄糖淀粉酶与α-淀粉酶添加比例对黑米糖化液中还原糖含量的影响Fig.3 Effect of glucoamylase and α-amylase addition ratio on reducing sugar content in black rice saccharification solution

2.4 酶解温度优化

酶解温度对黑米糖化液中还原糖含量的影响如图 4所示，在 45～65℃范围内，还原糖含量分别为2.49、3.65、3.93、4.09、3.83g/100g，目标产物的生成量随着反应体系温度的升高呈现先上升后下降的趋势。在反应过程中，淀粉酶的特殊靶向位点与目标底物相结合。提高反应温度，酶解速度会逐渐加快，但酶的本质是蛋白质，温度将改变蛋白质分子的多维空间构象，并影响其结合位点的活性高低。反应温度过高会导致葡萄糖淀粉酶与α-淀粉酶的稳定性降低，会逐步使酶分子变性，进而影响酶和目标物的有效结合，最终使酶解反应效率下降。因此，黑米酶解的较适宜温度定为60℃。

图4 酶解温度对黑米糖化液中还原糖含量的影响Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on reducing sugar content in black rice saccharification solution

2.5 酶解pH优化

酶解 pH对黑米糖化液中还原糖含量的影响如图 5 所示，当酶解 pH 分别为 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5时，酶解液中还原糖的含量分别为 3.19、4.15、3.91、3.88、3.86g/100g，呈现先增大后减小的趋势。pH 影响酶分子的构象、催化基团中质子供体或质子受体所需的离子化状态和活性中心上必需基团的解离程度[14]。在糖化过程中需要控制反应体系的 pH 值，使2种淀粉酶活性中心表现出最大催化活力，进而提高酶促反应效率，缩短酶解时长。因此，将黑米糖化反应的初始pH值定为4.0。

图5 酶解pH对黑米糖化液中还原糖含量的影响Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis pH on reducing sugar content in black rice saccharification solution

2.6 正交实验结果

2.6.1 实验因素与水平

根据上述单因素实验结果，选取对黑米酶解过程中还原糖含量影响较大的温度、pH、酶添加量这3个因素，以酶解液中的还原糖含量为指标进行L9(34)的正交实验。实验方案及实验结果见表 2，方差分析结果见表3。

2.6.2 正交实验结果与分析

由表 2、表 3可知，温度和 pH因素对黑米糖化反应过程中的还原糖含量有显著性影响，各因素极差值分别为0.340、0.490、0.194，3个因素对其响应值的影响主次顺序为pH〉温度〉酶添加量。因素A温度以 A2水平最适，因素 B pH以 B2水平最适，因素 C酶添加量以 C3水平最适。因此，最佳发酵条件为温度60℃、pH 4.0、酶添加量0.8%。