西瓜霜润喉片微生物限度检查方法的建立

2022-07-29曹鲁娜毕言锋王静郑兆显

中国合理用药探索 2022年5期

曹鲁娜，毕言锋，王静，郑兆显

菏泽市食品药品检验检测研究院，菏泽 274032

西瓜霜润喉片为《中国药典》2020 年版一部收载的中成药，属独家生产品种，由西瓜霜、冰片、薄荷素油、薄荷脑4 种原料药制成，具有清音利咽、消肿止痛的功效，用于防治咽喉肿痛、声音嘶哑等病症，疗效显著［1-2］，临床应用广泛［3-5］。邹节明等［6］研究发现，西瓜霜润喉片具有抑菌作用。为确保微生物限度检查结果的准确性，使其可客观反映样品被微生物污染的真实水平，需在进行微生物限度检查前通过查阅文献、分析组方药味的抑菌活性等对样品特性进行初步研判并进行预试验，对有抑菌活性的样品，应选择适宜的方法去除其活性后再进行检查。

本研究首先通过平皿法筛选出敏感菌株，而后参考相关文献［7-9］，结合微生物限度标准和生产企业提供的资料，采用3 批样品进行3 次独立平行试验的方法，建立了基于中和法的西瓜霜润喉片微生物限度检查方法。现报道如下。

1 材料

1.1 仪器

BSC-1300ⅡA2 型生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）；JE1201 型电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）；DNP-9162BS-Ⅱ型电热恒温培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；BPH-9272 型精密恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；MLS-3781L-PC 型高压蒸汽灭菌器（松下健康医疗器械株式会社）。

1.2 试药

胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA，批号201225）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA，批号201214）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB，批号201214）、沙氏葡萄糖液体培养基（SDB，批号201112）、肠道菌增菌液体培养基（EE，批号191231）、pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号210310）均由北京陆桥技术股份有限公司提供；聚山梨酯80（国药集团化学试剂有限公司）；培养基经过适用性检查，均符合标准要求。西瓜霜润喉片（桂林三金药业股份有限公司，批号210307、210308、210617）。

1.3 菌种

金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］、铜绿假单胞菌［CMCC（B）10104］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］、大肠埃希菌［CMCC（B）44102］及乙型副伤寒沙门菌［CMCC（B）50094］均购自广东环凯微生物科技有限公司，经本实验室复苏复壮传代并鉴定合格，本次试验所用菌株均为第4 代。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

2.1.1 平皿倾注法

取西瓜霜润喉片10g，加入TSB 至100ml，用匀浆仪混匀，制成1∶10 的供试品溶液。取1∶10的供试液适量，加入TSB 依法制成1∶50、1∶100的不同浓度供试品溶液［10］。

2.1.2 中和法

取西瓜霜润喉片10g，加入含10%聚山梨酯80 的TSB 至100ml，用匀浆仪混匀，制成1∶10的供试品溶液。

2.2 菌液的制备

将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌分别接种于TSB 中，33℃培养24h；白色念珠菌接种于SDB 中，23℃培养3 天；黑曲霉接种于SDA中，23℃培养7 天，制成新鲜培养物。取上述新鲜培养物，用pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液洗脱、稀释，分别制备成菌落数为1000～10 000cfu/ml 的菌悬液或孢子悬液，用于微生物计数。将铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌分别接种于TSB 中，33℃培养24h，制成新鲜培养物。取上述新鲜培养物用pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液洗脱、稀释，制备成菌落数为10～100cfu/ml 的菌悬液，用于控制菌检查。

2.3 计算方法与结果判断

需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的回收比值依据公式计算：回收比值=（试验组菌落数-供试品对照组菌落数）/菌液对照组菌落数（公式1）。计数方法适用性试验采用平皿法或薄膜过滤法时，各试验菌回收比值应在0.5～2 范围内；控制菌检查适用性试验阳性对照组应检出试验菌，阴性对照组应无菌落生长。

2.4 计数方法适用性试验

2.4.1 平皿倾注法（1∶10）

试验组：取“2.1.1”项下1∶10 供试液9.9ml共5 份，分别加入“2.2”项下金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉5 种试验菌液各0.1ml，使每1ml 供试液中含菌量不大于100cfu，混匀，取1ml 注入平皿，平行制备2 个平皿。

供试品对照组：取“2.1.1”项下1∶10 供试液9.9ml，以TSB 代替试验菌液，其余操作同试验组。

菌液对照组：取TSB 9.9ml 共5 份，分别加入“2.2”项下金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉5 种试验菌液各0.1ml 进行菌种回收试验。

按照《中国药典》2020 年版四部［1］要求，在各组平皿中加入15～20ml 相对应的SDA（用于霉菌和酵母菌总数计数）或TSA（用于需氧菌总数计数），测定各平皿菌落数，计算3 次独立试验的平均回收比值，结果详见表1。

由表1 数据可知，采用平皿倾注法（1∶10）进行需氧菌总数计数时，金黄色葡萄球菌回收比值低于0.5，枯草芽孢杆菌回收比值为0，表明西瓜霜润喉片对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有抑菌活性，且对枯草芽孢杆菌的抑菌活性更强，提示可将二者作为敏感菌株进一步开展试验。霉菌和酵母菌总数计数的试验菌株回收比值均在0.5～2，表明该方法可行。

表1 平皿倾注法（1∶10）微生物计数适用性试验各试验菌株回收比值

2.4.2 增加稀释液体积

选取敏感菌株金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，采用平皿倾注法（1∶50，1∶100），选用1 批样品进行试验。取“2.1.1”项下1∶50、1∶100 供试液，试验菌液选取“2.2”项下用于微生物计数的金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，其余操作按“2.4.1”项下方法进行。结果显示，金黄色葡萄球菌的回收比值分别为0.35、0.56，枯草芽孢杆菌的回收比值分别为0.14、0.21。表明西瓜霜润喉片对枯草芽孢杆菌的抑菌活性很强，不宜继续采用增加稀释倍数的方法去除。

2.4.3 需氧菌总数测定

取“2.1.2”项下1∶10 供试液9.9ml 5 份，分别加入“2.2”项下用于微生物计数的5 种试验菌液各0.1ml，以含10%聚山梨酯80 的TSB 为稀释剂（代替TSB），其余操作按“2.4.1”项下步骤制备试验组、供试品对照组和菌液对照组。另取含10%聚山梨酯80 的TSB 9.9ml 作为中和剂对照组，共2 份，操作同“2.4.1”项下试验组操作步骤，进行中和剂的菌种回收试验。按照《中国药典》2020 年版四部［1］要求，在各组平皿中加入15～20ml TSA，测定各平皿菌落数，计算3 次独立试验的平均回收比值，结果详见表2。

由表2 可知，中和剂对照组菌株回收比值均符合标准，表明含10%聚山梨酯80 的TSB 对试验菌株无抑菌性且无损伤［11］。西瓜霜润喉片采用中和法进行需氧菌总数计数方法适用性试验时，试验菌株的回收比值均在0.5～2 范围内，表明该方法能有效去除西瓜霜润喉片的抑菌活性，可用于其微生物限度检查。

表2 中和法需氧菌总数适用性试验各试验菌株回收比值

2.5 控制菌检查方法适用性试验

按照《中国药典》2020 年版四部［1］要求，西瓜霜润喉片的控制菌检查应为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、耐胆盐革兰阴性菌和沙门菌5 种。

阳性对照组：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌3 种控制菌检查取“2.1.1”项下1∶10 供试液10ml；耐胆盐革兰阴性菌检查取相当于0.1g、0.01g 和0.001g 的预培养物（“2.1.1”项下1∶10 供试液23℃培养2h）；沙门菌检查取西瓜霜润喉片10g。上述供试液及供试品分别加入“2.2”项下用于控制菌检查的对应菌液，接种至对应的规定培养基，混匀，33℃培养24h。

试验组：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌3 种控制菌检查取“2.1.1”项下1∶10供试液10ml；耐胆盐革兰阴性菌检查取1ml 预培养物；沙门菌检查取西瓜霜润喉片10g，均不加试验菌液，其余操作同阳性对照组。

阴性对照组：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、耐胆盐革兰阴性菌和沙门菌5 种控制菌检查均以TSB 代替供试液，其余操作同试验组。

按照《中国药典》2020 年版四部［1］规定将各组进一步选择和分离培养。结果表明，按照常规培养基体积检查时，阴性对照组均无菌落生长，阳性对照组除沙门菌外，大肠埃希菌等4 个阳性对照组均检出试验菌，提示西瓜霜润喉片对沙门菌有抑菌活性，将稀释液增加至200ml 时，阳性对照组菌落生长良好，表明稀释法可以消除样品对沙门菌的抑菌活性。结果详见表3。

表3 控制菌方法适用性试验结果

3 讨论

3.1 样品抑菌活性的去除方法

方法适用性试验是微生物限度检查结果准确可靠的基础保证，其本质是建立对样品影响小且操作效率高的方法［12］。去除样品抑菌性是其中的重点和难点［13］，应遵循由简到繁、由单一到联合的原则。在非无菌制剂的微生物限度检查中，平皿倾注法因操作简捷、结果准确而最为常用，但西瓜霜润喉片的抑菌作用较强，采用稀释倍数1∶100 时枯草芽孢杆菌的回收比值仍小于0.5。常用的薄膜过滤法首先要求样品可通过微孔滤膜，本研究在制备1∶10供试液时发现不溶性颗粒较多，不宜选用。适宜的中和剂能有效降低样品抑菌活性，而且操作效率高，聚山梨酯80 是一种非离子表面活性剂，可增加药品溶解，且对微生物有一定的保护作用［14-16］，因此本研究使用聚山梨酯 80 作为中和剂。在选择去除样品抑菌活性的方法时，建议根据样品特性对拟采用方法进行评估，不要盲目按照药典收录的方法逐一尝试，避免大量的重复性工作。

3.2 敏感菌株的确定

在检验工作以及查阅文献资料［17-20］过程中发现，有抑菌活性的中药制剂在需氧菌总数计数中大多对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有抑菌作用。基于此，本研究选取金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌开展敏感菌株预试验，结果与文献报道一致。建议相关实验室通过实践工作或查阅资料后，选用1～2 种敏感菌株开展预试验进行方法筛选，并根据预试验结果进一步规范开展方法适用性试验，减少菌种使用量和检验工作量，降低试验过程中引入微生物污染的风险，提高检验准确性。