外源氯化钙对铅胁迫下水稻幼苗生长、SPAD值和荧光特性的影响

李雪梅， 黄禹翕， 蔡晓婧， 王银茹， 代成龙

(沈阳师范大学生命科学学院，辽宁沈阳 110034)

铅是典型的重金属污染物，土壤中高浓度的铅会直接或通过改变土壤中营养物质的微生物循环而破坏植物的生理结构。铅通过富集在食物内传递给人，长期摄入会对神经、生殖等系统造成严重影响。有研究表明，铅离子能够与某些酶活性中心的金属元素竞争，从而影响酶的正常活性，且能够通过干扰植物的渗透调节物质降低叶绿素含量，破坏光合作用系统，造成生理生化过程的紊乱，影响植物生长。

利用外源物质提高植物幼苗的光合效率，增强植株的抗逆性已经在许多植物上得到应用。对植物来说，钙离子是一种重要的矿质元素和信号物质，也是一种良好的膜保护剂，可以防止膜损伤，稳定其结构，保持膜的完整性。应用外源钙可以减少环境胁迫，如干旱、盐度和低温对植物细胞膜的伤害，增强植物细胞膜稳定性和提高植物的抵抗力。

1931年Kautsky和Hirsch发现叶绿素荧光后，由于叶绿素荧光技术有着快速、无损的特点，得到了蓬勃发展，被广泛应用于胁迫损伤等方面。目前，用于检测植物叶绿素荧光的仪器主要有2种，一种是脉冲调制式荧光仪，通过测量光合作用中的光反应阶段来反映光合作用中卡尔文循环等反应启动后的光能捕获、转化和利用情况；另一种是连续激发荧光仪，主要是通过短时光照后荧光信号的瞬时变化表现暗反应前PSⅡ的光化学变化，得到快速叶绿素荧光动力曲线。2种仪器都在一定程度上可以反映叶绿素荧光的变化，但都具有一定的局限性，若能使用2种仪器进行测量并进行分析，反映出的结论将更加全面。

目前有很多关于重金属胁迫对植物叶绿素荧光影响的研究，匡经舸等研究表明，铅胁迫可以使洋常春藤的和qN升高，和ETR降低。祁金洋等研究表明，铅胁迫降低了绢毛委陵菜/和/。但从叶绿素荧光角度探究外源氯化钙对铅胁迫的缓解作用相对较少。本研究采用水培法，通过喷施外源氯化钙处理铅胁迫下的水稻幼苗，利用2种叶绿素荧光仪研究外源氯化钙对铅胁迫后水稻幼苗叶绿素荧光相关指标的影响，旨在探究外源氯化钙对铅胁迫的缓解作用，从而为解决铅胁迫对植物的影响提供新思路。

1 材料与方法

本试验于2021年3月在沈阳师范大学大学生创新创业中心进行。

1.1 试验材料与处理

1.1.1 水稻幼苗的培养 本试验选用辽星1号水稻(L.)种子为试材。选取饱满的水稻种子，经过漂洗、消毒后，放入恒温培养箱30 ℃浸种24 h、催芽24 h，待种子露白后，将种子均匀地铺在盖有纱网的装有霍格兰(Hoagland)完全培养液的塑料烧杯中，每盆约100粒。后将种子放入人工培养箱(昼夜温度28 ℃/25 ℃，光照黑暗16 h/8 h，相对湿度80%，光照度10 000 lx)中培养，每日补充营养液2次，待幼苗长至2叶1心期时，进行外施氯化钙和铅胁迫处理。

1.1.2 外施氯化钙及铅胁迫处理 将0、10、20、30 mmol/L CaCl喷施在水稻幼苗叶片，CaCl预处理24 h后，对水稻幼苗进行铅胁迫模拟。将预处理后水稻幼苗换用含100 μmol/L Pb(NO)的Hoagland完全培养液培养。每个处理重复3次。

表1 外施氯化钙及铅处理

1.2 生长参数的测定

在铅胁迫后的第5天从每个处理中随机选择10株幼苗测定其株高、根长和鲜质量。将称完鲜质量的水稻幼苗样品烘干至恒质量，测其干质量。

1.3 SPAD值的测定

在铅胁迫后的第4天，从每个处理中随机选8株幼苗叶片，用叶绿素含量测定仪(SPAD-502Plus，日本)在叶片的相同部位测定SPAD值。

1.4 快速叶绿素荧光动力曲线、叶绿素荧光参数和图像的测定

1.4.1 快速叶绿素荧光动力曲线、基础荧光参数、比活性参数和能量分配比率的测定 在铅胁迫后的第4天，采用连续激发式荧光仪(Pocket PEA，英国)进行测定。每个处理随机选取3株水稻，用暗处理夹夹住叶片的同一部位，关闭遮光片进行暗处理30 min后，得到快速叶绿素荧光动力曲线，测定基础荧光参数，同时计算比活性参数和能量分配比率，参数及生物学意义见表2。

表2 基础荧光参数、比活性参数及能量分配比率

1.4.2 荧光淬灭动力系数、荧光衰减率和图像的测定 在铅胁迫后的第4天，用脉冲调制式荧光仪(Fluorcam，捷克) 测定相关参数及图像。从每个处理中随机选取1株水稻的第2张叶，对其进行 15 min 暗处理后，测量光化学淬灭系数()和荧光衰减率()，在测量的同时，捕获到CCD镜头下的实时荧光图像，打开Flashes测量光，调整至清晰的图像，得到最大PSⅡ光量子效率(/)和光化学淬灭系数()的图像。

1.5 统计分析

采用Excel 2010处理数据并作图，采用SPSS 22. 0对相关数据进行单因素方差分析(<0.05)。

2 结果与分析

2.1 外源氯化钙处理对铅胁迫下水稻幼苗生长参数的影响

由表3可知，与CK相比，单铅胁迫处理株高显著下降(<0.05)，根长出现下降但不显著；在喷施了氯化钙后，株高较单铅胁迫处理均有显著上升(<0.05)，T2处理的根长比单铅胁迫处理显著增加，说明外源氯化钙处理能够减轻铅在株高、根长上的影响。地上部和地下部鲜质量在单铅胁迫后均出现了显著降低(<0.05)，而在施加了氯化钙后，各浓度处理均发生了显著上升(<0.05)；对于干质量，各处理均未出现明显变化。

表3 外源氯化钙处理对铅胁迫下水稻幼苗生长参数的影响

2.2 外源氯化钙处理对铅胁迫下水稻幼苗叶片SPAD值的影响

从图1可以看出，水稻幼苗在单铅胁迫下SPAD值出现了显著下降(<0.05)，外施不同浓度的氯化钙后，各氯化钙处理较单铅胁迫处理均显著上升，但各浓度之间存在差异。其中，用10、20 mmol/L 氯化钙处理上升十分明显，接近CK；30 mmol/L 氯化钙处理相较单铅胁迫处理也发生显著升高(<0.05)，但显著低于10、20 mmol/L氯化钙处理。

2.3 外源氯化钙处理对铅胁迫下水稻幼苗快速叶绿素荧光动力曲线的影响

如图2-a所示，各处理均表现出标准的OJIP曲线形状，单铅胁迫处理的曲线I点、P点相比于CK组，均出现下降，说明铅对水稻幼苗叶片造成了一定损伤；10、20、30 mmol/L氯化钙处理的曲线I点和P点均出现上升，其中上升最明显的是 20 mmol/L 氯化钙处理，说明外源氯化钙能够缓解铅对叶片反应中心活性的伤害。

对OJIP荧光曲线进行标准化后得到相对荧光变化曲线(图2-b)，单铅胁迫处理的J点明显上升，说明电子从Q向Q的传递受到限制；施加氯化钙后的各处理相比于单铅胁迫处理J点荧光均出现下降，其中20 mmol/L氯化钙处理下降程度最大，这表明氯化钙处理减轻了铅对电子传递的影响。

Δ代表K点的情况，K点表明放氧复合体(OEC)受到伤害的程度，由图2-c可知，单铅胁迫处理的Δ明显上升，10、20、30 mmol/L氯化钙处理的Δ均出现一定程度的下降，其中 20 mmol/L 氯化钙处理下降程度最大，所以氯化钙能够减轻对OEC的损伤。

2.4 外源氯化钙处理对铅胁迫下水稻幼苗叶绿素荧光参数的影响

2.4.1 对叶绿素基本参数的影响反映暗适应后的最小荧光，是指植物充分适应黑暗后，光反应中心完全开放时获得的荧光。由图3可知，单铅胁迫处理显著高于CK，这说明铅破坏了幼苗叶片的反应中心；而施加氯化钙的各处理相比于单铅胁迫处理出现了显著降低(<0.05)。

表示暗适应后的最大荧光。由图4可知，单铅胁迫处理的显著高于CK (<0.05)，施加氯化钙后，均有所下降，但各浓度降低程度不同，10 mmol/L氯化钙处理显著降低，20、 30 mmol/L 氯化钙处理组降低未达到显著水平。

/代表植物体最大PSⅡ光量子效率，是反映植物抵抗逆境最具代表性的指标之一。由图5可知，与CK相比，单铅胁迫处理的/显著下降(<0.05)，外施氯化钙的各处理相比于单铅胁迫处理显著升高，但不同浓度间没有特别明显的差异。说明铅对PSⅡ反应中心的损伤较为显著，同时，氯化钙能够在一定程度上提高光能的转换效率，减轻铅胁迫带来的损伤。

2.4.2 对荧光淬灭动力系数及荧光衰减率的影响 光化学淬灭系数()能体现PSⅡ激发能获得的效率。如图6所示，单铅胁迫处理较CK显著下降(<0.05)，而外施氯化钙的各处理相比单铅胁迫均发生了显著上升，说明氯化钙改变了铅胁迫下水稻幼苗的能量转换途径。

是稳态荧光衰减率，经常被用来反映植物的活力状态。如图7所示，水稻受到铅胁迫后，值相比于CK出现了显著下降(<0.05)，在施加了氯化钙后，各处理均有了明显的上升(<0.05)，其中20 mmol/L氯化钙处理的上升趋势最明显。这说明水稻受到铅胁迫后，活力有所下降，同时氯化钙能够在一定程度上恢复水稻的活力。

2.4.3 对非活性参数的影响 由图8可知，与CK相比，单铅胁迫下ABS/RC、TRo/RC和DIo/RC均出现了显著升高(<0.05)。 这表明铅胁迫使能量的分配方式和份额发生变化。在施加不同浓度的氯化钙后，对于ABS/RC，10、20 mmol/L氯化钙处理均发生了显著降低(<0.05)；30 mmol/L氯化钙处理没有出现明显降低。对于TRo/RC，10、20 mmol/L 氯化钙处理的下降程度均达到显著 (<0.05)；30 mmol/L氯化钙处理没有明显降低。对于DIo/RC，10、20 mmol/L氯化钙处理均发生了显著下降(<0.05)；30 mmol/L氯化钙处理变化不显著。

2.4.4 对能量分配比率的影响 由图9可知，与CK相比，单铅胁迫下和均出现了显著下降；出现了显著上升 (<0.05)。这表明铅胁迫使PSⅡ受体侧的电子和量子传递、转化均受到了一定影响。与单铅胁迫相比，对于，10、20 mmol/L氯化钙处理未发生明显的升高，30 mmol/L氯化钙处理出现了显著降低(<0.05)；对于，10、20 mmol/L 氯化钙处理的下降程度均达到显著 (<0.05)，30 mmol/L氯化钙处理没有出现明显的降低；对于，20 mmol/L氯化钙处理上升显著，30 mmol/L氯化钙处理出现显著下降(<0.05)，10 mmol/L氯化钙处理未出现显著变化。

2.5 外源氯化钙处理对铅胁迫下水稻幼苗叶绿素荧光图像的影响

由图10可以直观地看出，对于/，单铅胁迫处理的叶片整体上活性较低，特别是两端部分所受伤害最为严重，而施加了氯化钙的各处理，叶片活性升高，说明氯化钙提高了水稻抵抗铅胁迫的能力，这与Pocket PEA测量出的数据所反映的趋势是一致的。对于，单铅胁迫处理的叶片整体上活性较低，上部边缘损伤极为明显，而加入不同浓度的氯化钙后，各组活性均出现一定的升高，这也说明施加氯化钙后水稻幼苗的能量能够被更有效的利用。

3 讨论与结论

植物生长过程对铅胁迫非常敏感，铅胁迫会严重影响植物的生长发育，导致植物生物量减少，这与王马勃等对茅苍术的研究结果、李西等对草坪草的研究结果一致。本研究中，对水稻幼苗外施不同浓度的氯化钙后，都在不同程度上增加了水稻幼苗的株高、根长、地上部和地下部鲜质量，这说明氯化钙能够减轻铅胁迫对植物生长的抑制作用。

叶绿体是光合作用的重要场所，其叶绿素含量高低是植物光合能力高低的主要指标之一。SPAD值代表的是植物叶绿素的相对含量，本试验表明单铅胁迫降低叶绿素含量，而氯化钙能够增加SPAD值，从而促进水稻幼苗光合作用的进行。

叶绿素荧光诱导的快速动力学曲线含有丰富的关于PSⅡ反应中心的主要光化学反应的信息，对其分析提供了环境条件对光合作用机制影响的信息，主要是PSⅡ的供体侧、受体侧和反应中心。Pb胁迫处理OJIP曲线较CK组I点、P点下降、K点、J点上升，其中K点的出现表明囊泡所具有的膜流动性发生改变，导致PSⅡ复合物的稳定性下降，从而导致PSⅡ复合物的功能和结构完整性下降。在施加氯化钙后，各处理组K点和J点下降且I点和P点出现不同程度的升高。这表现外源氯化钙对PSⅡ供、受体侧均起到了保护作用。

植物能够通过刺激各种防御机制来应对生物和非生物胁迫，还能够在面临胁迫时迅速检测外部刺激并产生和传递信号。铅胁迫使和升高，这是由反应中心失活造成的，同时使/下降，表明造成了植物PSⅡ部分失活或伤害。在外施氯化钙后，和值下降，/出现上升，这反映出氯化钙能够提高水稻幼苗的抗铅胁迫的能力，恢复反应中心活性。此外，2种仪器测量的数值和图像均反映出相同的趋势。

植物在正常条件下吸收的光能主要在3个步骤中消耗：光合作用电子转移、叶绿素荧光发射和散热。 这3种途径之间又存在此消彼长的关系，所以通过测定荧光变化可以了解光合作用和热耗散的情况。反映了原初反应中原初电子受体的还原情况和PSⅡ开放的程度，所代表的是稳态荧光衰减率。本试验中，铅胁迫显著降低了和，说明铅胁迫改变了光能的消耗途径，PSⅡ开放的程度降低，植物活力下降，能量可能更多以热能的形式散失。对于施加氯化钙的各组，和的数值均有一定的升高，说明水稻幼苗的能量更多地被有效利用，植物体活性有所提高。

比活性参数反映的是卡尔文循环开始前，植物体能量吸收、转化、传递和利用的过程。、和表现了PSⅡ受体侧能量分配的比率。单铅胁迫下ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC和均显著升高，和数值均出现了显著下降，说明铅改变了能量的利用方式和份额，更多的能量以热能的形式被消耗，从而降低了用于传递电子的能量比例。对于外施10、20 mmol/L氯化钙组的ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC和均显著下降，和数值上升，且2组趋势较为一致，这表明外施氯化钙处理在能量运动方式上明显区别于单铅胁迫组，在一定程度上改善铅对于能量运动方式的影响，被有效利用的能量更多，从而促进水稻幼苗的正常生长和光合作用；30 mmol/L氯化钙处理组相比于单铅胁迫组ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC差别不大，升高更多，和降低更为明显，这可能是由于钙离子浓度过高对铅胁迫水稻幼苗的伤害造成了近一步伤害。

通过以上结果可以看出，外源氯化钙可以有效降低铅胁迫对水稻幼苗生长的抑制，提高铅胁迫下水稻幼苗SPAD值、光能利用效率。这主要是外源氯化钙提高了水稻幼苗光合电子传递效率，对PSⅡ反应中心起到保护作用，在一定程度上缓解了铅胁迫对水稻PSⅡ的伤害。其次，综合来看，外施10、20 mmol/L CaCl处理效果更理想。综上，适宜浓度的外源氯化钙能够在一定程度上对铅胁迫下的水稻幼苗起到缓解作用，从而能够为减轻铅对植物的伤害提供理论依据，为解决铅对于农业方面的影响提供新思路。