加工辣椒无损品质检测方法及典型相关性分析

巩雪峰， 陈 鑫， 李 红， 许 艺， 宋占锋

(四川省农业科学院园艺研究所/蔬菜种质与品种创新四川省重点实验室/农业农村部西南地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，四川成都 610066)

加工专用型辣椒选育是近年来我国各大辣椒产区育种者的重要育种目标。在加工辣椒品种的选育过程中，研究者除了考虑植株产量、稳产性、抗性等性状外，辣椒果实的加工品质性状也是衡量品种优劣的重要指标内容。通常对加工辣椒品质性状指标的研究主要集中在色泽、营养、风味、质地这4个影响指标上。其中，辣椒红素色价用于对色泽品质的评价，辣椒素含量用于对风味品质的评价，粗脂肪含量(或油分)等用于对营养品质的评价，粗纤维含量等用于对质地品质的评价。目前，对色价、辣椒素、粗脂肪及粗纤维含量等性状的检测通常是运用植物生理、生化学方法，通过研磨、匀浆、离心、旋蒸、生化反应或抽提等精细的样品前处理，并借助液相色谱、紫外分光光度计等大型仪器分析而获得。通过传统的理化品质性状分析方法所得检测值具有精度高、数据稳定的优点，但是操作流程繁琐，测量时间长，获得数据结果周期性大，试剂耗材价格昂贵，而且当同期辣椒杂交组合增多、果实样品存放不得当或前处理不及时时，测量过程中会导致果实样本理化活性降低，样本之间误差系数增大的情况出现，极大影响了对品质性状筛选的准确性，非常不利于加工辣椒品种选育工作。因此，建立一套快速、高效的无损品质检测体系，且能够替代经典传统理化品质性状的检测方法，将有助于加速加工辣椒的品种选育进程。

无损检测技术是利用声、光、电、力等相关物理学特性，在果蔬等样品的理化性质为非破损状态下，通过对其内外部信息扫描获取与分析评价的技术。本研究将无损检测技术的近红外光谱与色差技术引入了加工辣椒的果实品质性状分析中。有关近红外光谱(near infrared reflectance spectrum，简称NIRS)技术应用，目前在粮油、饲料等农业领域已有一系列现行国家与国际NIRS定量检测标准体系，包括了对水分、蛋白质、脂肪含量等品质指标的标准检测。近年来，虽然近红外光谱技术用于检测蔬菜品质的研究报道也越来越多，但并未形成相对成熟的体系。辣椒已发展为全国第一大蔬菜作物，有关辣椒近红外光谱检测的前沿报道也相对较多，包括辣椒素、可溶固形物、维生素C含量等果实品质性状，但是对粗脂肪和纤维素含量的分析鲜有报道；色差技术是基于色差原理，运用光学设计和信号处理技术，通过应用色差仪(即分光测色仪)来模拟人眼的视觉系统进行色彩测量，使颜色数量化的一种分析方法。有关色差技术的应用，包括研究者运用色差仪对桑白皮、黄芩等中药材颜色与有效成分进行相关性分析。研究者还通过色差仪对黄瓜、甜瓜、辣椒等果皮颜色进行了遗传学及其他关联分析。但是，将色差仪应用于辣椒品质检测的研究鲜有报道。

本研究通过建立辣椒果实的辣椒素、粗纤维和粗脂肪的近红外定标模型，通过分析色差与色价的相关性，并运用典型相关性统计学分析，研究辣椒无损品质变量组与理化性状变量组之间的相关关系，讨论辣椒果实品质性状无损检测方法的快速、高效检测的可行性。本研究旨在建立准确、高效、体系化的辣椒无损品质性状检测方法，以期为加工辣椒品质筛选提供科学有效的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2020年1月至8月在四川省农业科学院新都试验基地进行。供试辣椒材料为123份加工型杂交组合材料，于1月在连栋大棚内进行穴盘播种，4月露地定植，8月进行采收。采收时每份供试样品选取20株生长一致的辣椒，采摘每株结果主枝的第4～6节位的果实，每份供试样品采收500 g果实鲜样，鲜样采收后迅速置于泡沫冰盒内冷藏保鲜。

1.2 试验方法

1.2.1 备样 从基地采收至实验室的123份辣椒果实鲜样按顺序装入牛皮纸袋，于60 ℃鼓风干燥箱中烘干至恒质量，用粉碎机粉碎后过40目筛，最终获得粉末状干样保存在塑封袋内，冷藏于4 ℃冰箱待测。123份待测干样品将用于色价、辣椒素、粗纤维、粗脂肪含量的理化性状测定及无损品质性状分析。

1.2.2 理化性状测定项目与方法 辣椒素含量采用NY/T 1381—2007《辣椒素的测定 高效液相色谱法》的方法测定。称取0.2 g待测干样并精确到0.000 1 g，向称取的样品中加入25 mL甲醇-四氢呋喃溶液，在60 ℃水浴条件下，用超声波提取器提取30 min，过滤，收集滤液，将滤渣连同滤纸重新用25 mL甲醇-四氢呋喃溶液经超声提取器提取 10 min 后，再重复1次。将3次过滤收集的滤液合并，在70～75 ℃恒温水浴下浓缩至30 mL左右，转移至50 mL容量瓶，用甲醇-四氢呋喃溶液定容，经0.45 μm有机相滤膜过滤后进行色谱分析。色谱条件：色谱柱，C150 mm×4.6 mm，粒径5 μm；流动相为甲醇 ∶水=4 ∶1(体积比)，用前过0.45 μm滤膜，脱气；流速为0.6 mL/min；荧光检测器的激发波长为229 nm，发射波长为320 nm；进样量为10 μL。

式中：为试样中辣椒素的峰面积积分值；为标准工作液中辣椒素的峰面积积分值；为标准工作液中辣椒素的质量浓度，mg/L；为试样最终定容体积，mL；为试样质量，g。

粗脂肪含量采用索氏抽提法测定。称取2.0 g待测干样并精确到0.000 1 g，用滤纸包好，在 105 ℃ 烘箱中干燥3 h取出，在干燥器中冷却，称质量()。将样包装入索氏脂肪抽提器抽提筒中，再倒入无水乙醚，完全浸泡样包，连接好索氏抽提器各部分，浸泡至少16 h。将浸泡后的样包放入抽提瓶中，在抽提瓶中放入几粒沸石，然后，往抽提瓶中倒入无水乙醚使之完全浸泡样包，连接好仪器各部分，接通冷凝水，在70～80 ℃水浴上加热，使乙醚回流，控制乙醚回流次数为8 次/h，即乙醚回滴速度为120～150 滴/min，抽提6 h。抽提完毕，取出样包，置样包于通风处使乙醚挥发。将样包放入105 ℃烘箱中干燥2 h，取出，在干燥器中冷却，称质量()。

式中：为第1次烘干的质量，g；为第2次烘干的质量，g；为称取试样的质量，g。

粗纤维含量采用GB/T 5009.10—2003《植物类食品中粗纤维的测定》方法测定。称取5.0 g待测干样，移入500 mL锥形瓶中，加入200 mL煮沸的1.25%硫酸，加热使其微沸，保持体积恒定，持续 30 min，定时晃动锥形瓶，使瓶内物质混合充分；取下锥形瓶，迅速用亚麻布过滤，用沸水洗涤至洗液呈酸性；再用200 mL，煮沸的1.25%氢氧化钾溶液，将亚麻布上的存留物洗入原锥形瓶内加热至沸腾后持续30 min，取下锥形瓶，立即以亚麻布过滤，以沸水洗涤2 ～3次后，移入已干燥称质量的G2垂融坩埚或同型号的垂融漏斗中，抽滤，用热水充分洗涤后抽干。再依次用乙醇和乙醚洗涤1次。将坩埚和内容物在105 ℃烘箱中烘干后称量，重复操作，至恒质量。

式中：为残余物的质量，g；为样品质量，g。

辣椒红素色价采用国标GB 1886.34—2015《食品安全国家标准 食品添加剂 辣椒红》的方法测定。称取0.1 g 待测干样并精确到0.000 1 g，用无水乙醇取代丙酮浸提样品中的辣椒红素。将浸提液按序点样在96孔酶标板上，用多功能酶标仪(赛默飞世尔Multiskan GO)在460 nm处读取吸光度值，96孔板的通径长度为0.58 cm。

式中：为460 nm处样本的吸光度；为稀释倍数；为样本称量质量；为96孔酶标板的通径长度。

以上所有理化性状测定项目的各样品均做重复3次，结果为3次试验的均值。

1.2.3 无损品质性状检测的方法 近红外光谱检测采用福斯(FOSS)NIRS DS2500 型近红外光谱仪，光谱区范围为400～2 500 nm，光谱分辨率为 0.5 nm，测量方式为漫反射。

光谱采集：将123份供试样品的待测干样20 g按序逐一装入样品杯中，用压块压实进行扫描。每个样品测定2次，第1次测定后的干样与原待测样品混匀后，再取样20 g进行第2次测定，获取光谱。扫描获得所有样品的近红外光谱。

建立定标模型：123份样品的理化性状测定值结合所对应近红外光谱，通过WinISI定标软件系统进行建模。用WinISI将全部样品材料随机分为建模集和验证集2个部分，建模集用于建立定标方程和模型的内部交叉检验，验证集用于模型的外部验证。对建模集进行计算得分，剔除马氏距离(GlobalH，简称GH)大于3的特异样本，获得定标集。用定标集建立定标方程，用标准正常化处理+去偏异技术(SNV+Detrend)进行散射校正，用改进式偏最小二乘(modifiedpartial least square，简称MPLS)回归方法分析定标样本，通过定标建立预测模型。

1.2.4 数据统计与分析 每个检测指标重复测定3次取平均值。利用Microsoft Excel 2016进行数据图表处理；用SPSS 16.0进行数据的Kolmogorov-Smirnov检验(KS-检验)、正态分布、回归分析、相关性关系及典型相关性分析等数理统计学分析。

2 结果与分析

2.1 辣椒果实理化性状结果分析

测得123份供试样品理生化性状数据结果见表1，可以看出辣椒素、粗脂肪、粗纤维含量和色价的变幅和极差都较大，基本包含了加工型辣椒育种研究的各品质性状的变幅范围。供试样品4个理化性状的KS-检验分析表明辣椒素、粗脂肪、粗纤维含量和色价的渐进显著性(双侧)分别为0.398、0.681、0.113、0.998，均大于0，说明4个理化性状指标服从正态分布。由图1可知，供试样品辣椒素含量、粗脂肪含量、粗纤维含量和色价值符合正态分布情况，进一步说明选择供试样品的理化性状辣椒素、粗脂肪和粗纤维含量符合近红外光谱建模要求。

表1 辣椒果实样品生理生化性状统计

2.2 辣椒素、粗脂肪和粗纤维含量的无损 NIRS模型建立与预测效果分析

2.2.1 辣椒果实样本近红外光谱特征 对123份辣椒供试样品分别进行光谱扫描，获得近红外光谱见图2。辣椒样品在全波长850～2 500 nm范围内，包含了多个光谱吸收峰；不同辣椒样品由于对近红外光吸收特征的不同，所表现出的光谱图是有所差异的，说明辣椒供试样品间成分及含量的差异。

2.2.2 NIRS数学模型的内部交叉检验 根据已经测定的辣椒素、粗脂肪、粗纤维含量结合各辣椒供试样品相对应的近红外光谱分别拟合数学模型。通过操作WinISI软件，按照建模集与验证集3 ∶1的比例，将外部验证的验证集光谱个数设为30，其他样本作为建模集并通过计算得分剔除特异样本，最终用于定标集定标的光谱样本数量见表2。辣椒素、粗脂肪和粗纤维含量均具有较高的定标决定系数(RSQ)和交叉验证决定系数(1-VR)，同时，交叉验证误差(SECV)和校正标准偏差(SEC)均较低，其中粗脂肪的RSQ和1-VR最高，分别是0.983 5和0.980 0；SECV和SEC分别为0.128 3和0.111 8。尽管辣椒素含量的各决定系数较之最低，但是其RSQ和1-VR(分别是0.839 3和0.752 2)及SECV和SEC(分别为0.078 1和0.064 5)接近化学分析的精确度。说明所建模型各项决定系数和标准误差可以满足辣椒样品辣椒素、粗脂肪和粗纤维含量分析，均达到了预期效果。

表2 辣椒粗脂肪、粗纤维和辣椒素含量的定标、交叉验证结果

2.2.3 定标模型对品质性状预测效果分析 对建立的定标模型的实际预测效果进行外部验证，如图3所示，辣椒素、粗脂肪和粗纤维含量预测值与理化性状值的回归分析中，决定系数均大于0.8，结果表明，预测值与3个理化性状值都比较接近，变量与自变量之间具有较好的线性关系。

2.3 色差分析及色差与色价的相关性分析

表3 辣椒果实样品色差度测定结果

表4 辣椒果实色价与色度相关性关系分析结果

2.4 辣椒无损品质与理化性状的典型相关性分析

表5 生理生化指标与品质性状的典型相关性分析

理化性状为第1组变量，无损品质性状为第2组变量，二者之间计算共得4组相关系数，4组相关系数均达到极显著水平(<0.01)。第1典型相关系数为0.973，第2、3、4典型相关系数分别为0.954、0.750、0.719。其中，第1典型相关系数均大于各自的简单相关分析的相关系数。中脂肪含量()和粗纤维含量()的系数绝对值明显大于其他2个理化性状系数，对应中，粗脂肪近红外NIRS值()和粗纤维近红外NIRS值()的系数绝对值也明显大于其他2个品质性状，说明第1对典型相关主要由、和、这2组变量相关引起的。

3 讨论与结论

本研究运用近红外光谱分析技术建立了辣椒果实样品的辣椒素、粗脂肪和粗纤维含量的近红外定标预测模型。粗脂肪、粗纤维含量模型的定标决定系数和交互验证决定系数均大于0.98，外部验证决定系数(分别为0.937、0.967)也均大于0.9，是具有较高的稳定性和准确度的。李沿飞等分别建立了干椒辣度和鲜椒辣椒素的近红外最优定标模型，近红外模型的定标集和外部预测决定系数在0.8以上，本研究辣椒素预测模型的定标决定系数、交互验证决定系数及外部预测决定系数均在0.8以上，与前人研究结果基本一致，说明该辣椒素定标预测模型的可用于实际预测。另外，在饲草、油料学科中Williams等在评价近红外光谱定标预测模型时，用相对分析误差值对模型进行评价，其中，交互验证集相对分析误差=样品集标准差/定标集标准偏差；验证集相对分析误差=样品标准差/验证集标准误差，当2个相对分析误差≥3.0 时，则能够精确预测相关成分含量。本研究获得的辣椒素、粗脂肪和粗纤维含量定标预测模型的交互验证集相对分析误差和验证集相对分析误差均在3.0以上。结果表明，运用无损近红外光谱技术对辣椒果实样品的辣椒素、粗脂肪和粗纤维含量检测具有稳定性、准确性、可行性，可以实现辣椒素、粗脂肪、粗纤维含量的高效检测。

本研究为建立加工辣椒无损品质性状检测方法的体系化提供了数据支撑。研究初步建立了可以实现用简单、快速、易测且样品使用量不大的体系化方法，对加工辣椒品质育种的快速可靠筛选，这对加工辣椒选育实践具有重大的意义。