微管相关蛋白1轻链3、叉头框蛋白Q1、生存素在食管鳞状细胞癌中的表达及对术后复发的预测价值

彭凤翔，高蓉梅，李永春，叶小娟

(武警四川省总队医院，四川 乐山614000)

近年来食管状细胞癌发生率有不断增加的趋势，其可划分为鳞状上皮细胞癌(ESCC)及腺癌两种类型，ESCC发病率高达90%左右[1]。该疾病在满足手术条件时应该优先选择手术切除治疗，可以切除病灶组织，但术后复发的风险比较高。寻找预后相关基因，预测ESCC术后复发的发生，成为了当下研究的关注点[2]。微管相关蛋白1轻链3(LC3)编码蛋白可用于对细胞自噬进行判断，在肿瘤的病理变化具有重要的调控作用[3，4]。叉头框蛋白Q1(FOXQ1)是结构中有叉头框结构的高保守转录因子，其和肿瘤的生物活动密切相关[5]。生存素(Survivin)在肿瘤细胞凋亡中可起到一定抑制作用，可促进肿瘤生长[6]。本文基于蛋白质印迹法检测LC3、FOXQ1、survuvin表达对患者行食管鳞癌根治术后复发的预测价值，为预后评估提供支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料2018年3月至2020年3月我院行手术治疗的86例ESCC患者，纳入标准：①满足食管癌诊断标准[7]； ②术前都没有给予手术外的其他治疗；③患者不存在精神障碍；④对相关研究情况知情同意。排除标准：①精神异常，无法正常交流; ②存在严重的心、脑相关脏器功能障碍；③同时进行放化疗。男62例，女24例，年龄45～80岁。病理组织低、中、高分化分别为30、24、32例；TNM分期Ⅰ～Ⅲ期分别为20、22、44例；肿瘤部位上段36例，中段27例，下段23例；合并淋巴结转移30例，无淋巴结转移56例。两组一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法主要试剂：兔抗人LC3、FOXQ1及Survivin相关的单抗全部来源于Abcam公司；GAPDH单克隆抗体(上海江莱公司)；对应的特异性引物通过上海生工合成，相关情况见表1。Trizol试剂、DAB试剂盒(上海江莱公司)；BCA试剂盒(北京中科公司)。实时荧光定量逆转录-PCR：采集癌组织、癌旁组织作为样本，-70 ℃保存。裂解法提取样本中总RNA，经反转录获得逆转录cDNA，条件如下：在 37 ℃培育15 min，85 ℃， 5 s。依据Direct PCR Kit规范进行扩增处理。采用2-△△Ct法测定LC3、FOXQ1、survuvin相对表达量。免疫印迹法检测：裂解法提取样本中总蛋白，经凝胶电泳处理后转膜，室温下封闭1 h后，加入LC3、FOXQ1、survuvin一抗(均进行千倍稀释)后4 ℃摇床培育十二小时，加入标记的二抗后接着根据要求培养1 h；洗膜，成像对所得影像结果通过Quantity-one工具处理，确定吸光度，然后把结果相除计算出其与GAPDH的比值为相对表达量。

表1 PT-PCR引物序列

1.3 统计学方法应用SPSS 22.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差描述，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；应用ROC曲线分析LC3、FOXQ1、survuvin对术后复发的预测价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ESCC癌组织中蛋白表达与癌旁组织相比，癌组织中的LC3 mRNA水平更低，其余两个相对表达量高(P<0.05)。蛋白质印迹法结果表明，与癌旁组织相比，癌组织中的LC3水平低，而FOXQ1、survuvin两种蛋白的表达水平高(P<0.05)。见图1。肿瘤浸润深度为T3～T4、分化程度为低分化、TNM分期为Ⅲ期和有淋巴结转移患者癌组织中LC3蛋白表达水平低于肿瘤浸润深度为T1～T2、分化程度为中高分化、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期和无淋巴结转移患者，FOXQ1和survuvin蛋白表达水平高于肿瘤浸润深度为T1～T2、分化程度为中高分化、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期和无淋巴结转移患者(P<0.05)，见表2。

图1 食管鳞癌根治术标本LC3、FOXQ1和survuvin表达 a:蛋白表达图谱；b:mRNA相对表达量；c:蛋白相对表达量

表2 不同临床病理特征患者癌组织中三种蛋白表达水平的比较

2.2 复发和未复发患者LC3、FOXQ1、survuvin蛋白表达水平比较术后随访12个月，复发患者26例(30.23%)，复发患者LC3蛋白水平低于未复发者，FOXQ1、survuvin蛋白表达水高于未复发者(P<0. 05)。见表 3。

表3 复发和未复发患者LC3、FOXQ1、survuvin蛋白表达水平比较

2.3 LC3、FOXQ1、survuvin对术后复发的预测价值分析LC3、FOXQ1、survuvin及其联合检测预测食管鳞状细胞癌根治术后复发的AUC分别为0.660、0.704、0.785、0.903，联合检测的AUC最高(P<0.05)。见图2、表4。

图2 LC3、FOXQ1、survuvin单独应用与联合应用的ROC曲线

表4 LC3、FOXQ1、survuvin三种指标及联合指标的ROC曲线分析

3 讨论

食管癌发生率有不断增加趋势，每年都有大量此类患者由于各种原因影响而死亡。根据临床经验可知这种疾病在发病初期阶段没有明显的病症，进食过程中会产生异物感。在发现很明显梗阻情况下，一般可判断病情已经很严重，进入了中晚期[8]。在这种疾病的临床治疗领域，常用的方法为食管癌根治术，根据实际的经验可知这种治疗方法的优势为创伤小、恢复快，适用性强，患者接受度高。有的患者会出现局部复发相关的问题，这对其疗效产生不良影响[9]。近年来一些学者研究发现肿瘤的发生机制很复杂，也受到自噬因素影响[10]。一些学者研究表明，食管癌肿瘤中自噬现象很普遍，有必要对此进行研究[11]。LC3为一种重要的自噬相关的基因，在检测自噬水平方面有很高应用价值，也被当做为主要的标记物[12]。发生自噬情况下，LC3-Ⅰ被修饰和加工，且结合自噬膜表面特定的物质而形成LC3-Ⅱ，因而可以将其当做为一种特定的标记蛋白[13]。FOXQ1是重要的转录因子，其可以通过识别并结合下游靶基因的启动子, 在此基础上实现基因调节目的。这种蛋白可利用Wnt/β信号转导通路参与恶性肿瘤细胞的侵袭活动[14]。survuvin是由细胞蛋白受体-1cDNA分离出来的，存在于细胞周期的G2/M期，通过有丝分裂加速细胞增殖，对其凋亡起到抑制作用，进而促进了肿瘤病理过程[15]。由此可见，LC3、FOXQ1及survuvin均参与了肿瘤细胞的各方面病理活动，且对病情进展有直接决定作用。

结果发现，和癌旁组织相比，癌组织中LC3蛋白和mRNA水平下降，而FOXQ1和survuvin的提高。由此可判断出这三种基因的表达与这种肿瘤的病理活动有关。本研究分析了LC3、FOXQ1及survuvin表达水平与肿瘤病理特征的关系，结果表明，肿瘤浸润深度为T3～T4、分化程度为低分化、TNM分期为Ⅲ期和有淋巴结转移患者癌组织中LC3蛋白表达水平明显降低，FOXQ1和survuvin蛋白表达水平明显升高。杨燕[16]对此进行研究，其所得结果发现LC3蛋白在乳腺癌不同肿瘤分期和淋巴结转移患者中表达水平存在显著差异。崔晓海等[17]研究表明，胃癌组织中FOXQ1基因表达水平明显提高，且其表达水平淋巴结转移、肿瘤体积、及 TNM 分期等有关。Shi等[18]研究表明，survuvin表达与鼻咽癌患者的肿瘤分期、分化和转移等有关。本研究结果与上述研究类似，表明LC3、FOXQ1及survuvin表达水平可以反映食管癌的肿瘤进展。在对患者进行术后12个月随访发现，复发患者LC3蛋白表达水平明显降低；FOXQ1、survuvin蛋白表达水平显著高于未复发者。且通过ROC曲线分析发现，LC3、FOXQ1及survuvin三指联合检测灵敏度、特异度最高，对患者行食管鳞癌根治术后复发具有预测价值。

综上所述，食管鳞状细胞癌组织中LC3低表达，FOXQ1、survuvin高表达，三者结合起来可更准确的进行术后复发率预测，为此类患者的治疗提供支持。本研究纳入的样本量少，且未进行随访研究观察患者生存情况，进行多中心大样本分析，应对这三种基因影响作用的具体分子机制做进一步探究。