丁苯酞对帕金森病伴抑郁小鼠黑质纹状体NLRP3和IBA-1表达的影响

杨浩辉 刘斌 李炳翰 范少凯 张艳淑

PD是一种多发于中老年期的第二大神经变性疾病，临床以运动迟缓、肌僵直、震颤为主要表现。同时，PD病人也常会出现一些非运动症状，例如抑郁、认知障碍、睡眠障碍、胃肠道障碍等，并且可能发生在运动障碍之前，成为预警疾病。抑郁症是PD病人中最常见且更容易被忽视的一种非运动症状。有研究提示，35%～42%的PD病人出现抑郁表现[1]，严重影响着病人的预后及生活质量。研究发现PD病人脑组织中小胶质细胞呈现出显著的激活状态，提示小胶质细胞介导的炎症反应可能参与PD的发生发展[2]。并且有研究证明，小胶质细胞的自噬可抑制炎症小体核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3, NLRP3)的激活[3]。近年来，NLRP3介导的神经炎症被认为对PD的发病机制有深远影响。NLRP3激活的caspase-1和IL-1β/IL-18是宿主免疫反应的重要介质[4]。实验证明，NLRP3是促进神经毒素MPTP诱导PD发病的关键炎症小体，选择性抑制NLRP3可减轻PD模型小鼠的行为缺陷和神经炎性[5]。美多芭是左旋多巴和苄丝肼组成的复方制剂，是目前治疗PD的常用临床药物，可有效缓解PD症状，但长期治疗会引起诸多不良反应，如姿势不稳、自主神经功能紊乱等，并且其在非运动症状，如抑郁、睡眠、觉醒障碍等方面收效甚微[6]。丁苯酞是一种从芹属种子中提取分离的化合物，是我国自主研发的用于治疗缺血性脑卒中的药物，它可以通过抑制炎症反应、保护线粒体功能、抗氧化应激及减少细胞凋亡等机制保护神经细胞。丁苯酞也可能通过上述机制对PD合并抑郁起到治疗作用[7-8]。有学者通过体内、体外实验证实，丁苯酞不仅能抑制小胶质细胞的激活，还能减少促炎因子的表达，从而起到抑制炎症、保护多巴胺能神经元的作用[9]。本文通过观察丁苯酞对PD合并抑郁小鼠的NLRP3及小胶质细胞标志蛋白IBA-1表达的影响，探讨丁苯酞治疗PD伴抑郁的效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6周龄C57雄性小鼠40只(25～30 g)，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号：SCXK(京)2020-0004]，常温适应性饲养1周。本动物实验经华北理工大学动物实验伦理委员会审批通过(审批号：LAEC-NCST-2020082)。

1.2 主要试剂 NLRP3、IBA-1一抗购自Affinity公司，二抗(羊抗兔)购自美国KPL公司，β-actin购自美国Proeintech公司，二喹啉甲酸(BCA)试剂盒购自Affinity公司。

1.3 模型制备及分组处理 随机选取10只小鼠为正常对照组，其余30只小鼠通过腹腔注射MPTP[30 mg/(kg·d)]7 d制备PD小鼠模型(均已通过转棒试验、悬挂试验、爬杆试验确认)，并对其进行不可预知温和应激刺激构建PD伴抑郁小鼠模型。刺激包括：禁食、禁水、冷水游泳、热烘、潮笼、昼夜颠倒、夹尾、束缚等，其中各项刺激随机安排，每种刺激重复2～3次，刺激周期为21 d[10]。然后将30只模型小鼠随机分为PD伴抑郁组、美多芭治疗组及美多芭联合丁苯酞治疗组，每组10只。PD伴抑郁组小鼠不再做处理；美多芭治疗组小鼠给予美多芭(6.25 mg/kg)灌胃治疗，1次/d，持续1周；美多芭联合丁苯酞治疗组小鼠给予美多芭(6.25 mg/kg)和丁苯酞(120 mg/kg)灌胃治疗，1次/d，持续1周。

1.4 行为学测试 通过强迫游泳测试、悬尾测试和糖水偏好实验对所有小鼠行为进行评价。

1.4.1 强迫游泳测试：使用一个水容器(20 cm×30 cm×20 cm)来测试游泳分数。水深10 cm，水温22～25 ℃，强迫游泳1 min，观察6 min，察看小鼠的不动时间并记录。

1.4.2 悬尾测试：将小鼠尾部后1/3处用医用胶带挂在测试箱内钩上，持续悬挂6 min，分析后4 min中的小鼠不动时间并记录。

1.4.3 糖水偏好实验：将小鼠单笼饲养，给予2%糖水3 d，在进行实验前禁水16～18 h，再同时给予小鼠2%糖水及纯净水，测试2 h，检查糖水消耗量与纯净水消耗量，计算糖水偏好率=糖水消耗量/(糖水消耗量+纯净水消耗量)×100%。

1.5 NLRP3及IBA-1蛋白表达检测 采用蛋白印迹法检测各组小鼠黑质纹状体区NLRP3及IBA-1的蛋白表达情况。操作步骤如下：腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠后，右心耳处注入0.9%氯化钠溶液，排出血管内存血，待小鼠眼球变白后，断头取脑，剥离黑质纹状体组织，将组织样本破碎处理，然后在组织中加入裂解液，比例为每20 mg组织150～250μL裂解液，保证破碎处理后的样本被充分裂解，离心取上清液置于EP管中-20 ℃保存备用；采用BCA法检测目的蛋白浓度，操作步骤按照试剂盒说明书进行，绘制标准曲线，根据所测样品的吸光度值计算样品浓度；蛋白样品在100 ℃条件下煮沸5 min变性、13 000 r/min离心15 min，-20 ℃保存备用；制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶，依次加入MARKER、检测样品并记录顺序，80 V电泳20 min，后改110 V继续电泳分离胶，采用半干转法转膜，转膜后5%脱脂奶粉封闭，摇床摇匀后封闭保存60 min，PBST缓冲液反复洗膜后加入一抗，孵育后4 ℃冰箱过夜，次日收集一抗，洗膜后加入二抗，回收二抗并洗膜，PBST缓冲液清洗3次后放入显影板上，加显影液显影，Image J软件进行灰度值测定分析。

1.6 观察小胶质细胞激活情况及多巴胺神经元损伤情况 采用石蜡切片免疫荧光技术观察各组小鼠黑质纹状体区的小胶质细胞激活情况及多巴胺神经元损伤情况。操作步骤如下：新鲜脑组织加入固定液固定，定位目的部位组织，流水冲洗后置于梯度酒精脱水，行石蜡包埋，切片机切片(厚4μm)后置于60 ℃烘箱烤片；切片脱蜡至水后，将其置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(pH 6.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，自然冷却后PBS洗涤3次，每次5 min；画圈血清封闭，加一抗，湿盒4 ℃孵育过夜；PBS洗涤3次，每次5 min，切片稍甩干后在圈内滴加二抗，避光孵育50 min；PBS洗涤3次，每次5 min，切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min；PBS洗涤3次，每次5 min，切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片，镜检拍照。石蜡切片免疫荧光结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外光的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光。

2 结果

2.1 各组小鼠行为学比较 与正常对照组相比，PD伴抑郁组的强迫游泳静止时间及悬尾静止时间均显著延长，糖水偏好率显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与PD伴抑郁组相比，美多芭治疗组及美多芭联合丁苯酞治疗组的强迫游泳静止时间及悬尾静止时间均显著缩短，糖水偏好率显著增高，且以美多芭联合丁苯酞治疗组更为明显，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠行为学比较

2.2 各组小鼠黑质纹状体区NLRP3、IBA-1蛋白表达量比较 与正常对照组相比，模型小鼠的NLRP3、IBA-1蛋白表达量均明显升高，差异具有统计学意义(均P<0.05)；与PD伴抑郁组相比，美多芭治疗组及美多芭联合丁苯酞治疗组的NLRP3、IBA-1蛋白表达量均有所下降，且以美多芭联合丁苯酞治疗组下降更为明显，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：ZC：正常对照组；PDD：PD伴抑郁组；MD：美多芭治疗组；M+D：美多芭联合丁苯酞治疗组

2.3 各组小鼠黑质纹状体区多巴胺神经元损伤情况 400倍视野下观察各组小鼠酪氨酸羟化酶(TH)荧光标记(绿色)多巴胺神经元损伤情况。与正常对照组相比，模型小鼠的多巴胺神经元细胞数量明显减少，并且细胞体受到不同程度的破坏，形态缩小；与PD伴抑郁组相比，美多芭联合丁苯酞治疗组的多巴胺神经元细胞数量明显增多。见图2。

注：A：正常对照组；B：PD伴抑郁组；C：美多芭治疗组；D：美多芭联合丁苯酞治疗组

2.4 各组小鼠黑质纹状体区小胶质细胞激活情况 400倍视野下观察各组小鼠黑质纹状体区IBA-1荧光标记(红色)小胶质细胞表达情况。与正常对照组相比，模型小鼠异常激活的小胶质细胞数量明显增多，胞体变大，轴突减少；与PD伴抑郁组相比，美多芭联合丁苯酞治疗组过度活化小胶质细胞数量明显减少。见图3。

注：A：正常对照组；B：PD伴抑郁组；C：美多芭治疗组；D：美多芭联合丁苯酞治疗组

3 讨论

PD的发病机制众说纷纭，炎症反应是其中一个被广为研究讨论的话题。有研究证明胶质细胞激活是α-突触核蛋白包涵体形成之前的早期事件，这表明神经炎症可能在PD的发病早期发挥重要的作用[11]。本研究结果显示，相较于正常小鼠，代表炎症反应的NLRP3以及代表小胶质细胞的IBA-1在模型小鼠中的表达量明显升高。

错误折叠的蛋白质是神经退行性疾病的共同特征，已有研究认为α-突触核蛋白-NLRP3介导的炎症反应可能是PD的病理生理基础[12]。本研究中模型小鼠的NLRP3蛋白表达水平较正常小鼠明显升高，且随着PD症状的减轻，NLRP3的蛋白表达水平也相应地降低。那么根据这一结果，NLRP3炎症信号标志物将有助于血源性α-突触核蛋白在PD诊断中的应用，并可能成为早期发现PD的新方法。而且活化的NLRP3导致半胱天冬酶-1蛋白水解活化，促进前IL-1β的裂解和IL-1β、IL-18促炎细胞因子的形成，进而加剧炎症反应[13]，提示NLRP3介导的炎症反应在PD发病机制中扮演着重要角色。

小胶质细胞在NLRP3介导的炎症反应中起着关键作用，NLRP3炎症小体的过度激活促进了小胶质细胞的促炎状态，而NLRP3炎症小体的抑制剂或小胶质细胞自噬诱导剂可以通过抑制促炎状态或促进向抗炎状态的转变来保护小胶质细胞的正常功能[14]。有学者通过体外和体内实验证实，小胶质细胞自噬功能受损可导致NLRP3炎性小体激活增强[15]。丁苯酞的主要成分为人工合成消旋正丁基苯肽，临床上常用于急性脑血管病，可明显改善血清炎性因子水平，促进病人神经功能和自理能力的恢复[16]。已有研究发现，在缺血性脑损伤模型中，丁苯酞可抑制星形胶质细胞及小胶质细胞活化，抑制NLRP3/ASC/Caspase-1通路的激活[17]。本研究也发现，美多芭联合丁苯酞治疗组小鼠的NLRP3及IBA-1蛋白表达量较PD伴抑郁组及美多芭治疗组小鼠显著减少，并且抑郁行为也有所改善。然而联合使用小胶质细胞自噬诱导剂和NLRP3炎症小体的特异性抑制剂在抑制NLRP3炎症小体介导的神经炎症中的优越性，需要未来进一步的临床研究验证。

综上分析，小胶质细胞/炎症小体介导的炎症机制可能参与PD伴抑郁的发生；丁苯酞可能通过抑制小胶质细胞及炎症小体的激活、减轻炎症反应来改善PD伴抑郁小鼠的抑郁症状。