基于AFLP分子标记的杂色杜父鱼遗传多样性分析

闫春梅 高春山 陈伟强 李忠强 金香琴

(吉林省水产科学研究院，吉林长春 130033)

杂色杜父鱼(Cottuspoecilopus)又名大头鱼、大头星，隶属于鲉形目、杜父鱼科、杜父鱼属，在中国分布于黑龙江、鸭绿江和图们江水系。该鱼主要生活在江河最上游，喜栖息在清澈、有砂石的冷水中，其体色与栖息河道底色相近，因而不易被发现[1-3]。野生杂色杜父鱼以水生昆虫及其幼虫、底栖生物为食，生存环境绿色环保，是典型的绿色食品，符合当前消费者对健康饮食、绿色食品的需求。目前，国内关于杂色杜父鱼还仅限于初步的生物学研究[4]，其种质资源现状及遗传多样性等领域的研究尚属空白。

扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)标记是一种显性标记，仅显示单个显性的等位基因。AFLP标记所需开发时间较少，获得数据方便，结果可靠[5]，具有灵敏度高、重复性好、信息量丰富等优点[6]，已被广泛应用于水生动物遗传多样性研究中[7-9]。本研究利用AFLP技术在分子生态学领域研究杂色杜父鱼的种质资源现状，分析其遗传多样性，旨在为探明杂色杜父鱼群体遗传多样性状况提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 材料

试验用杂色杜父鱼采捕自吉林省内不同江段，共计30尾，其中鸭绿江上游5尾，编号为61001～61005；三道松江河分两次采集，分别采集5尾和10尾，编号为FS090201～FS090205和51301～51310；漫江10尾，编号为FS090501～FS090510。样品信息详见表1。剪取样本尾鳍置于95%乙醇中固定保存。

表1 样品信息

引物由北京鼎国生物技术有限公司生产，PCR相关试剂购自TaKaRa公司，AFLP试剂盒及其他试剂均购自北京鼎国生物技术有限公司。

1.2 DNA提取

DNA提取参照酚-氯仿-异戊醇法[10]。应用微量分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，4 ℃保存。

1.3 AFLP分析

AFLP反应参照AFLP试剂盒说明的方法进行，对其中部分因素进行了优化。

1.3.1 酶切连接

酶切连接一步进行，20 μL反应体系包括：模板DNA 4 μL(50 ng/μL)；Adapter 1 μL；EcoR I/MseI 2 μL；10X Reaction buffer 2.5 μL；10 mM ATP 2.5 μL；T4 Ligase 1 μL；AFLP-Water 7 μL。混匀，离心数秒，37 ℃保温5 h，8 ℃保温4 h，4 ℃保存过夜。接头引物序列详见表2。

表2 AFLP接头及预扩增引物序列

1.3.2 预扩增

预扩增采用25 μL反应体系，包括:模板DNA 2 μL；预扩增引物(EcoR I/MseI 50 ng/μL等比混合)1 μL；dNTPs 1 μL；10X PCR buffer 2.5 μL；TaqDNA polymerase 0.5 μL；ddH2O 18 μL。瞬时离心混合均匀后，94 ℃变性30 s，56 ℃复性30 s，72 ℃延伸80 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。

1.3.3 选择性扩增

将预扩增产物以1∶20稀释，作为选扩模板。选择性扩增为25 μL反应体系，包括：预扩增产物稀释样品2 μL；10X PCR buffer 2.5 μL；dNTPs 0.5 μL；EcoR I 引物 1 μL(共8种)；MseI 引物 1 μL(共8种)，Taq酶 0.5 μL；ddH2O 17.5 μL。混匀后瞬时离心。94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，以后每轮循环温度递减0.7 ℃，扩增12轮。接着按94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，扩增23轮。选择性扩增引物序列见表3。

表3 选择性扩增引物序列

1.3.4 AFLP图谱分析

应用ABI 377测序仪进行AFLP多态性分析。

1.4 数据分析

用GENESCAN 3.1软件进行数据提取。再通过Binthere软件提取样品各片段的大小。利用EXCEL软件对数据进行01矩阵统计，不为0的数值转换为1(为0的数值不转换)，生成由“l”和“0”组成的原始矩阵。利用Popgen 32软件进行多态性位点、位点总数、多态性位点频率、观测等位基因数、有效等位基因数、Nei’s多样性指数、Shannon’s信息指数等遗传学数据统计。用NTSYSpc-2.11F软件对原始矩阵用SimQual程序求DICE相似系数矩阵，并获得相似系数矩阵。用SHAN程序中的UPGMA方法进行聚类分析，并通过Tree plot模块生成聚类图。

2 结果

2.1 AFLP选择性扩增结果

选择性引物EcoR I和MseI两两组合后进行筛选，选择多态性好且条带清晰的引物组合8组，对30尾杂色杜父鱼进行AFLP遗传多样性分析。结果显示，8组引物共扩增出915个位点，其中多态性位点843个，占比92.1%。引物组合E8M7多态性位点比例最高，达到98.2%；引物组合E3M3多态性比率最低，为75.9%(见表4)。

表4 8组引物多态性分析

2.2 遗传多样性分析

利用筛选得到的8组引物对采集到的3个群体共计30尾杂色杜父鱼的DNA样本进行PCR扩增，扩增产物经ABI 377测序仪进行AFLP多态性分析。选择Rox500红色荧光标记Marker，片段范围为70～500 bp，见图1。

图1 引物E-ACA/M-CAC扩增产物图谱

利用Popgen 32软件分析观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s多样性指数(H)和Shannon’s信息指数(I)。结果显示，8对引物组合中，E7M2的各项参数值均为最高，其观测等位基因数为1.634 3，有效等位基因数为1.207 4，Nei’s多样性指数为0.131 9，Shannon’s信息指数为0.214 2。E3M3组合的各项参数值则最低，其观测等位基因数为1.291 7，有效等位基因数为1.142 9，Nei’s多样性指数为0.084 5，Shannon’s信息指数为0.128 6。3个群体相比，漫江群体的各项参数均最高，其观测等位基因数为1.316 6，有效等位基因数为1.151 7，Nei’s多样性指数为0.091 2，Shannon’s信息指数为0.141 0；三道松江河群体次之；鸭绿江上游群体各项参数均为最低(见表5)。

表5 杂色杜父鱼遗传参数比较

利用Popgen 32软件对3个群体的遗传分化情况进行分析。结果显示，8对引物组合的Gst值在0.158 5～0.364 1。其中，E3M3、E3M6、E8M1的Gst值较大，分别为0.356 4、0.364 1和0.318 4，E7M2的Gst值最小，3个群体的平均Gst值为0.286 0，表明3个群体间发生了一定程度的遗传分化(见表6)。

表6 3个群体间的遗传分化系数

30尾杂色杜父鱼的遗传相似性在0.809 0～0.945 6。其中，3个群体内遗传相似性分别为：鸭绿江上游群体0.888 9～0.917 2，平均0.903 2；三道松江河群体0.840 9～0.945 6，平均0.912 1；漫江群体0.837 4～0.929 4，平均0.891 4。利用8对引物对30尾杂色杜父鱼进行UPGMA聚类分析，结果显示，30尾杂色杜父鱼样本中，除三道松江河的51304号和漫江的FS090501号个体外，其余28尾样本均按照采集地域分别聚为1支。漫江群体和鸭绿江上游群体聚为1支，三道松江河群体单独为1支(见图2)。

图2 30尾杂色杜父鱼样本的系统进化树

3 讨论

3.1 分子标记

遗传物质由亲本传递给子代的方式是可以预测的，可以通过分子标记进行个体间遗传关系的推断。但分子标记只是用于产生数据的工具，恰当选择分子标记是进行遗传关系分析的关键因素之一。要区分亲缘关系较近的生物，需要有高变异的分子标记。

分子标记主要分为共显性标记和显性标记。共显性标记包括等位酶[11]、RFLP[12-13]、SNP[14-15]和SSR[16-17]等多种标记方法，可以鉴定某一特定位点上出现的所有等位基因，而显性标记仅显示单个显性的等位基因，也称为多位点标记，包括RAPD[18-19]和AFLP[20]。AFLP使用随机引物对多个基因组区域进行DNA扩增鉴定，显示出相当高水平的多态性，可用于推断较近的遗传关系。共显性标记数据比显性标记数据更为精确，但显性标记所需要的开发时间少，且获得数据更为方便，因此，近些年显性标记在水生生物遗传多样性分析中被广泛应用。

3.2 种群遗传多样性分析

遗传多样性是衡量一个种群种质资源质量的重要指标[21]，丰富的遗传多样性意味着物种具有较高的适应生存潜力、蕴藏着较大的进化潜能[22-23]。本研究主要从观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s多样性指数(H)、Shannon’s信息指数(I)、总群体杂合度(Ht)、亚群体杂合度(Hs)、遗传分化系数(Gst)和群体遗传相似性等几个遗传多样性分析常用指标对吉林省内不同地域采集的30尾杂色杜父鱼个体进行AFLP遗传分析。共筛选出8组多态性好且条带清晰的引物，对30尾杂色杜父鱼的DNA样本进行了PCR扩增，总计扩增出915个条带，其中多态性位点843个，多态性位点比例高达92.1%。在其他学者的同类研究中，如燕涛等[24]利用5对引物在27尾吉富罗非鱼个体中扩增出187个位点，多态位点比例为87.17%；巫旗生等[25]采用4对引物对8个养殖群体的239个葡萄牙牡蛎个体进行扩增，共得到331个位点，多态位点比例为70.39%；张丽艳等[26]利用8对引物对2个群体的60尾竹荚鱼个体进行扩增，共扩增出433个条带，多态位点比例为66.05%。与以上研究结果比较发现，本研究中30尾杂色杜父鱼的遗传多态性较高，原因可能是所采集的30尾杂色杜父鱼均来自野生环境，且采集自不同地域。这也表明吉林省内杂色杜父鱼种质资源质量较好。

3.3 遗传结构分析

本研究的30尾杂色杜父鱼样本分别采自吉林省三道松江河、漫江和鸭绿江上游等3个不同地域。对3个群体进行遗传结构及遗传变异分析，Na、Ne、H、I这4个指标结果显示，漫江群体各项参数值均最高，三道松江河群体次之，鸭绿江上游群体各项参数值最低。遗传杂合度反映的是各群体在每个位点上的遗传变异，一般认为，它是度量群体遗传变异的一个较合适的参数[27]。本研究的结果显示，采集的30尾杂色杜父鱼个体间存在较丰富的遗传变异，对环境具有较强的适应性。

遗传分化系数也是一项重要的研究群体遗传分化情况的指标。Wright[28]认为，遗传分化系数在0.05～0.15，表示群体之间的遗传分化处于中等程度。本研究利用Ht、Hs及Gst这3个指标值对3个群体的遗传分化情况进行分析，Gst平均值分别为0.111 0、0.079 9、0.286 0，表明3个群体之间的遗传分化处于中等偏上程度。

遗传相似性及UPGMA聚类分析结果显示，3个群体30尾杂色杜父鱼个体的遗传相似性较高，遗传距离较小。通过系统进化树明显看出，三道松江河群体15尾个体中有14尾较好地聚为1支，漫江群体10尾个体中有9尾较好地聚为1支，鸭绿江上游5尾个体全部聚为1支，仅有1尾三道松江河个体和1尾漫江个体单独聚为1支。这表明3个群体间出现了一定程度的分化，这与遗传分化系数显示的结果一致。同时，3个群体内部亲缘关系较近，可以较好地聚为1支。单独聚为1支的两个个体，可能是因为同批次采样，致使样品采集或处理过程中发生了交叉污染，也可能是由个体差异引起的。总体来看，3个群体的30尾杂色杜父鱼个体有93%以上按照地域特点分别聚类，群体间及群体内亲缘关系较近。