百里香酚对鱼源耐药性维氏气单胞菌的体外抑菌效果及其机制研究

吴玉如，梁天雨，梁 超，谭媛元，柳 源，潘星羽，黄小丽，陈德芳，耿 毅，欧阳萍，*

(四川农业大学 a.动物医学院；b.动物科技学院，四川 成都 611130)

传统中草药具有天然的抗菌活性，并且具有残留少、毒副作用小、安全性高、不易产生耐药性等特点，近年来逐渐成为替代抗生素的研究热点。但中草药的成分相对复杂，抑菌机制也具有多重性。因此，有必要深入研究不同中药成分的抑菌作用及其作用机制。根据文献报道，中草药活性成分的抑菌机制主要表现为对细菌细胞壁和细胞膜、蛋白质、遗传物质和呼吸代谢的影响。研究人员可以借助电子显微镜观察中药及其有效成分对细菌超微结构的影响；将碱性磷酸酶用作判定细菌细胞壁完整性的指标；通过细胞膜流动性、通透性、结构的变化和内容物外流来检测细胞膜的变化。

百里香酚(5-甲基-2-异丙基酚)，又名麝香草酚，是芳香植物精油的主要成分，具有广谱抑菌作用，对革兰氏阴性菌(大肠埃希菌、沙门氏菌等)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等)都具有良好的抑制作用，可以替代抗生素或与其联合使用。作者团队前期研究证实，百里香酚对鱼源耐药性维氏气单胞菌具有较好的抑菌作用，但是其抑菌机制尚不清楚。本研究拟探析百里香酚对维氏气单胞菌的抑菌机制，以期为相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株和主要试剂

维氏气单胞菌SC株分离自濒死黄颡鱼()，由四川农业大学水生动物疾病研究中心鉴定保存。

百里香酚(色谱纯，纯度>98%，CAS No.89-83-8)，购于上海展云化工有限公司，溶于二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma-Aldrich)，制成质量浓度为40.96 mg·mL的原液备用。LB肉汤和LB营养琼脂购于青岛海博生物技术有限公司；药敏纸片购于杭州微生物试剂有限公司；乳酸脱氢酶测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 维氏气单胞菌的药物敏感性检测

采用纸片扩散法(K-B法)，参照抗微生物药物敏感性试验执行标准[美国临床和实验室标准协会(CLSI)制定，2017年版]进行试验。用无菌棉签蘸取对数期的维氏气单胞菌菌液(1×10CFU·mL)均匀涂布于LB营养琼脂平板，待培养基表面干燥后，在超净工作台用无菌镊子分别放置直径6 mm的庆大霉素(gentamicin，GN)、阿奇霉素(azithromycin，AZM)、头孢克洛(cefaclor，CEC)、头孢噻肟(cefotaxime，CTX)、恩诺沙星(enrofloxacin，ENR)、环丙沙星(ciprofloxacin，CIP)、多黏菌素B(polymyxinB，PB)、复方新诺明(compound sulfamethoxazole，CO SMZ)、磺胺异恶唑(sulfisoxazole，SIZ)、氟苯尼考(florfenicol，FFC)、美罗培南(meropenem，MEM)、四环素(tetracycline，TE)药敏纸片，保持纸片间距离相等并做好标记。将平板放置于28 ℃恒温培养箱中培养24 h，测定并记录抑菌圈大小，根据CLSI 2017的标准判断维氏气单胞菌的药物敏感性。

1.3 百里香酚对维氏气单胞菌的抑菌活性

采用微量倍比稀释法测定百里香酚对维氏气单胞菌的最低抑菌浓度(MIC)。在96孔板中，对百里香酚进行连续2倍稀释，使其终浓度分别为1 024、512、256、128、64、32、16 μg·mL，另向每个孔加入1×10CFU·mL的菌液5 μL，以只加入菌液的孔作为阳性对照组，以加入DMSO的为阴性对照组，以加入LB液体培养基的为空白对照组。在28 ℃、150 r·min条件下于气浴恒温振荡器中培养24 h，观察每个孔的澄清度，以肉眼观察的无菌生长孔的百里香酚最低浓度为MIC值。

采用平板计数法测定百里香酚对维氏气单胞菌的最低杀菌浓度(MBC)。取肉眼观察的各澄清孔中溶液各30 μL，分别加入LB平板，均匀涂布，在28 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察菌落数，以生长菌落数不大于5的对应孔中的百里香酚浓度为MBC。

将维氏气单胞菌接种于LB液体培养基中，在28 ℃、150 r·min条件下于气浴恒温振荡器中培养24 h。用新鲜LB培养液稀释菌液至=0.3，分装于200 mL锥形瓶中，加入百里香酚，使培养基中百里香酚的质量浓度分别为0、32、64、128、256、512 μg·mL。将其置于气浴恒温振荡器中，在28 ℃、150 r·min条件下培养，分别于培养0、1、2、4、6、8、12、20、24 h时，取100 μL菌液加入96孔板，在Varioskan Flash全波长多功能酶标仪(美国Thermo Scientific)下测定其值，绘制维氏气单胞菌的生长曲线。

1.4 百里香酚对维氏气单胞菌膜通透性的影响

取培养至对数期(=1.0)的维氏气单胞菌悬液，加入质量浓度为512 μg·mL的百里香酚，置于气浴恒温振荡器中，在28 ℃、150 r·min条件下培养，分别于0、1、2、4、6、8 h取菌液1 mL，4 500 r·min离心10 min后，用无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH=7.4)重复洗涤3次，收集下层沉淀，重悬于1 mL的无菌PBS中，再加入40 mL 5%(质量分数)无菌葡萄糖溶液，测定其电导率。对照组加入等体积的DMSO。

1.5 百里香酚对维氏气单胞菌可溶性蛋白的影响

取培养至对数期(=1.0)的维氏气单胞菌悬液，加入质量浓度为512 μg·mL的百里香酚，置于气浴恒温振荡器中，在28 ℃、150 r·min条件下培养，分别于4、8、16、24 h取菌液1 mL，于4 500 r·min离心10 min，用无菌PBS洗涤3次并重悬，用超声破碎仪裂解菌体，4 500 r·min离心10 min后，收集上清液。取40 μL上清液与10 μL的5×蛋白上样缓冲液混匀，煮沸10 min。取混合上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳完毕后，使用考马斯亮蓝R250对胶染色过夜，煮沸洗脱染色剂，在Universal Hood Ⅱ全功能凝胶成像系统(美国BIO-RAD)中成像。对照组加入等体积的DMSO。

1.6 百里香酚对维氏气单胞菌乳酸脱氢酶活性的影响

向培养至对数期(=1.0)的菌液中加入质量浓度为512 μg·mL的百里香酚，分别于0、2、4、6、8 h取菌液1 mL，4 500 r·min离心10 min后倒去上清液，收集下层沉淀，用无菌PBS洗涤3次，重悬后用超声破碎仪对菌体进行破碎，按照乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物工程研究所)的要求操作。对照组加入等体积的DMSO。

1.7 百里香酚对维氏气单胞菌DNA外渗量的影响

向培养至对数期(=1.0)的维氏气单胞菌悬液中加入质量浓度为512 μg·mL的百里香酚，置于气浴恒温振荡器中，在28 ℃、150 r·min条件下培养，分别于0、1、2、4、6、8 h取菌液1 mL，于4 500 r·min离心10 min收集沉淀，用无菌PBS洗涤3次并重悬，取2 μL菌液用NanoDrop OneC超微量紫外分光光度计(美国Thermo Scientific)测定菌液中的DNA含量。对照组加入等体积的DMSO。

1.8 百里香酚对维氏气单胞菌DNA的影响(染色分析)

向培养至对数期(=1.0)的维氏气单胞菌悬液加入512 μg·mL的百里香酚，置于气浴恒温振荡器中，在28 ℃、150 r·min条件下培养，分别于0、2、4、8 h取菌液1 mL，用无菌PBS洗涤3次，于4 500 r·min离心10 min收集沉淀，加入2.5%(体积分数)的戊二醛1 mL重悬，静置10 min后于4 500 r·min离心10 min，收集菌体，再用1 mL无菌PBS重悬。取100 μL菌液加入等量的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，10 μg·mL)染料，避光静置反应10 min，4 500 r·min离心10 min，收集下层沉淀，并用200 μL无菌PBS洗涤3次，去除残余的DAPI染料，取5 μL重悬后的菌液加在无菌载玻片上，在BX53荧光显微镜(日本Olympus)下观察菌体。

1.9 百里香酚对维氏气单胞菌菌体形态的影响

将维氏气单胞菌在LB液体培养基中培养至对数期(=1.0)，加入512 μg·mL的百里香酚，培养4 h后，取菌液1 mL，于4 500 r·min离心10 min，收集下层沉淀，用PBS洗涤菌体3次，然后在4 ℃条件下重悬于2.5%(体积分数)的戊二醛，在Inspect扫描电子显微镜(SEM)(美国Thermo Scientific)下进行观察分析。将维氏气单胞菌与百里香酚共培养8、16 h后在透射电子显微镜(TEM)下进行观察分析，样品制备参照文献[20]的方法进行。对照组加入等体积的DMSO。

1.10 数据分析

各指标在测定时，均设置3个重复，取平均值。使用Prism 8.0软件对得到的数据进行方差分析和检验，以<0.05表示差异显著，<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 维氏气单胞菌SC株的耐药性

根据CLSI 2017的药敏试验判定标准，维氏气单胞菌SC株对氯霉素类的氟苯尼考和喹诺酮类的环丙沙星和恩诺沙星耐药，对-内酰胺类的头孢克洛、头孢噻肟和多黏菌素类的多黏菌素B敏感，对庆大霉素、美罗培南、四环素、阿奇霉素和复方新诺明中介(表1)。

表1 维氏气单胞菌SC株的耐药性

2.2 百里香酚对维氏气单胞菌SC株的体外抑菌活性

经测定，百里香酚对维氏气单胞菌SC株的MIC为256 μg·mL，MBC为512 μg·mL(图1)。当百里香酚的质量浓度达到或超过256 μg·mL时，菌液的值在24 h内趋近于0，表明此时百里香酚完全抑制维氏气单胞菌SC株的生长；当百里香酚的质量浓度低于MIC时，虽然对细菌的生长有一定的影响，但菌液的值与对照组相差不大。

图1 不同质量浓度的百里香酚对维氏气单胞菌SC株生长的影响

2.3 百里香酚对维氏气单胞菌SC株菌体膜通透性的影响

将维氏气单胞菌SC株与百里香酚共培养，通过测量菌悬液电导率的变化推断膜通透性的改变。添加512 μg·mL的百里香酚后，菌液电导率迅速增加，在6 h时达到最大值，并在8 h内一直保持较高的电导率，且始终与对照组差异极显著(<0.01)(图2)。上述结果表明，百里香酚能增大维氏气单胞菌SC株细胞膜的通透性。

“**”表示差异极显著(P<0.01)。下同。

2.4 百里香酚对维氏气单胞菌SC株可溶性蛋白的影响

用SDS-PAGE测定百里香酚对维氏气单胞菌可溶性蛋白的影响(图3)：对照组中，菌体蛋白泳道(泳道1、3、5、7)随着时间延长，条带逐渐增多并变深；试验组(添加512 μg·mL的百里香酚)菌体蛋白泳道(泳道2、4、6、8)随着时间延长，蛋白条带数量减少，颜色变浅，与对照组相比，某些蛋白条带(15～20 ku)甚至消失。

M代表Marker(蛋白质量标记)，泳道1、3、5、7分别对应于对照组4、8、16、24 h的菌体蛋白，泳道2、4、6、8分别对应于添加百里香酚(512 μg·mL-1)处理组4、8、16、24 h的菌体蛋白。

2.5 百里香酚对维氏气单胞菌SC株乳酸脱氢酶活性的影响

添加512 μg·mL的百里香酚后，菌液的乳酸脱氢酶活性与对照组相比极显著(<0.01)降低(图4)，并表现出时间依赖性，在2、4、6、8 h分别降低了(32.8±0.7)%、(46.2%±0.3)%、(46.1±1.6)%、(60.0±1.0)%，而对照组的乳酸脱氢酶活性始终维持在较高水平。

图4 百里香酚(512 μg·mL-1)对维氏气单胞菌SC株乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响

2.6 百里香酚对维氏气单胞菌SC株DNA外渗量的影响

DNA本身为大分子物质，正常情况下不会穿透完整的细胞膜和细胞壁。对照组菌液的DNA含量在0～8 h维持不变(图5)。加入512 μg·mL的百里香酚1 h后，菌液DNA含量迅速上升到(115.6±0.5)mg·L，并在8 h内稳定在110～120 mg·L，且始终与对照组差异极显著(<0.01)。这说明，百里香酚可以破坏维氏气单胞菌SC株细胞膜的完整性，导致DNA等大分子外渗。

图5 百里香酚(512 μg·mL-1)对维氏气单胞菌SC株DNA外渗量的影响

2.7 百里香酚对维氏气单胞菌SC株DNA的影响

DAPI可以透过完整的细菌细胞膜与DNA结合，并在特定的荧光条件下显现出荧光，且荧光强度与DNA含量成正比。对试验组(添加512 μg·mL的百里香酚)和对照组2、4、8 h的菌液进行DAPI染色观察，结果显示，试验组的荧光强度和密度明显低于对照组，且荧光强度随着处理时间的延长而降低(图6)。

A，对照组(0 h)；B～D，分别对应于百里香酚(512 μg·mL-1)处理2、4、8 h。

2.8 百里香酚对维氏气单胞菌SC株形态结构的影响

用SEM观察维氏气单胞菌SC株的超微结构：对照组的细胞完整清晰(图7)；百里香酚(512 μg·mL)处理4 h后，菌体表面明显出现塌陷、溶解和坏死。

A～B，扫描电镜(SEM)观察结果；C～F，透射电镜(TEM)观察结果。A，对照组，4 h；B，百里香酚(512 μg·mL-1)处理4 h，箭头指示菌体表面溶解塌陷；C，对照组，8 h；D，百里香酚(512 μg·mL-1)处理8 h，箭头指示细胞染色不均，并开始出现空泡化；E，对照组，16 h；F，百里香酚(512 μg·mL-1)处理16 h，箭头指示细胞膜与细胞壁分离，细胞皱缩坏死。

TEM观察可见：对照组细菌结构完整，生长、分裂正常；经百里香酚(512 μg·mL)处理后，细菌皱缩变形，细胞膜和细胞壁分离，由于细胞膜破损引起内容物流出，菌体内染色不均，甚至出现空泡化，且随着药物作用时间延长，呈现空泡化的细胞数量增多。

3 讨论

本研究对临床分离到的鱼源维氏气单胞菌进行药敏试验，发现其对水产养殖常用抗生素中的氟苯尼考和恩诺沙星耐药，对庆大霉素中介。吕观等的研究结果显示，32株维氏气单胞菌对恩诺沙星的耐药率达到100%；林煜等发现，大刺鳅源维氏气单胞菌对氟苯尼考和恩诺沙星等12种抗生素表现出耐药性。虽然来源于不同地区和宿主的维氏气单胞菌的耐药性存在一定差异，但对氟苯尼考和恩诺沙星都表现出较高的耐受性。本试验证实了百里香酚对耐药性维氏气单胞菌的体外抑菌活性，初步明确了其作用机制，可以为基于百里香酚的新型抗菌药物的研发提供理论和试验基础。

百里香酚能抑制耐药性维氏气单胞菌SC株的生长，其MIC和MBC分别为256 μg·mL和512 μg·mL。生长曲线测定结果表明：当药物浓度达到MIC时，就可以完全抑制维氏气单胞菌的生长；但在亚抑菌浓度下百里香酚对维氏气单胞菌的生长无明显抑制作用。因此，在生产中可以考虑采用与抗生素联合使用的方法提高百里香酚的抑菌效果，并降低其使用量。此外，据文献报道，百里香酚作为饲料添加剂喂养动物和鱼，还可以提高宿主的免疫力，增强其对病原菌的抵抗能力。

细菌菌体细胞膜具有选择通过性，可以稳定细菌的内部环境，屏蔽外界环境对细菌的影响。当细胞的细胞膜通透性受到破坏时，细胞膜的选择性下降，细胞内容物流出，导致菌液的电导率增加。经百里香酚处理后，维氏气单胞菌菌液的电导率明显升高，表明百里香酚可以增加细菌细胞膜通透性，导致细菌内电解质的外流。孙茂关于百里香酚抗小鼠金黄色葡萄球菌肺炎的药效学评价也表明，百里香酚可以改变细菌细胞膜通透性，导致内容物流出，从而抑制细菌生长。

蛋白质是机体生命活动的基础物质，机体内参与各种生命活动调节的酶大多数都是蛋白质。SDS-PAGE结果显示，百里香酚对维氏气单胞菌菌体的可溶性蛋白有抑制作用，并且这种抑制作用具有时间依赖性。维氏气单胞菌可溶性蛋白含量的降低可能与其细胞膜通透性的改变相关，也可能是因为百里香酚抑制了相关蛋白的生物合成，干扰了细菌的正常代谢，这与李振翼等和张猛等的研究结果相似。

乳酸脱氢酶可催化丙酮酸和乳酸的相互转化，是细菌代谢过程中具有重要作用的蛋白酶。百里香酚明显降低了维氏气单胞菌的乳酸脱氢酶活性，指示细胞膜和细胞壁受到损伤。该结果与SDS-PAGE结果一致，表明百里香酚可通过抑制菌体可溶性蛋白的合成，从而影响细菌代谢和生长。

DNA是携带生物体遗传信息的大分子，在存在完整细胞膜的情况下，不会通过生物膜；因此，菌液中的DNA含量亦可以反映细菌细胞膜结构的完整性。DNA外渗量增加表明百里香酚破坏了维氏气单胞菌细胞膜的完整性。有研究发现，百里香酚可以与金黄色葡萄球菌的DNA结合，改变其结构，从而发挥抗菌作用。

DAPI是一种能与DNA强力结合的荧光染料，能在不破坏细胞膜完整性的情况下进入细胞，并与DNA特异性结合，在荧光显微镜下显现荧光，且荧光强度与DNA含量呈正比。百里香酚处理的荧光强度低于对照组，推测百里香酚破坏了细胞膜的完整性，造成DNA外流，导致荧光强度大大降低，这与DNA外渗量的测定结果一致。蒋加鹏等推测，百里香酚可能通过影响相关基因的表达来抑制细菌的正常生长，但是百里香酚干扰核酸合成的具体机制还需要进一步研究。

电镜结果显示，经百里香酚处理后，维氏气单胞菌菌体出现表面溶解塌陷、皱缩变形，细胞壁和细胞膜分离，细胞质丢失，内部空化等现象，表明百里香酚会改变维氏气单胞菌的结构形态，破坏其细胞膜的完整性，与前述研究结论一致。

综上，百里香酚通过破坏耐药性维氏气单胞菌菌体结构，导致细胞壁和细胞膜分离，增加细胞膜通透性，从而抑制细菌生长繁殖。由此判断，百里香酚可以作为抑制耐药性维氏气单胞菌的潜在药物进行研发，但今后还需要进一步开展动物试验，对其安全性和有效性进行深入研究。