球孢白僵菌侵染普通齿蛉幼虫的显微观察和感病症状

袁靖泽，冯毅，曹成全，陈浩

（1.吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南 吉首 416000;2.西北农林科技大学植物保护学院,陕西 杨凌 712100;3.乐山师范学院生命科学学院,四川 乐山 614004）

广翅目Megaloptera齿蛉科Corydalidae巨齿蛉属与大型齿蛉属的幼体被通称为“爬沙虫”（曹成全，2014），是一类珍稀的药食两用昆虫（杨冬梅等，2012；石晏丞等，2019），在四川攀西地区有上百年的食用历史（曹成全等，2019），产业价值极高。但近年来，自然环境破坏和滥捕等因素造成了野生爬沙虫数量骤减，因此，人工繁育爬沙虫刻不容缓。

普通齿蛉为中国广布种（刘星月，2008），具有个体大、分布地域广、数量多等优点，成为人工繁育爬沙虫的重点种类。普通齿蛉的生活史较长，1～2年发生1代，幼虫期占整个生活史的绝大部分，需要经过10～12个龄期才能化蛹和羽化成虫。在人工养殖过程中发现，普通齿蛉幼虫死亡率较高，被菌类侵染是死亡原因之一，且普通齿蛉幼虫一旦相遇，极易发生打斗行为，进而在虫体表面产生严重程度不一的创伤，这些创伤成为了菌类侵染的易感区域。

前期养殖实践和试验发现，寄主范围较广的虫生寄生菌——球孢白僵菌易侵染普通齿蛉幼虫并造成虫体大量死亡。本文对球孢白僵菌侵染普通齿蛉幼虫体表与伤口进行了详细的研究，为了解侵染机理及防治球孢白僵菌侵染普通齿蛉幼虫进而提高养殖成活率提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和虫体

供试菌株购自山西绿海农药科技有限公司。菌株在马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）的斜面上进行分离并培养7 d左右，4℃储存。供试普通齿蛉末龄幼虫由乐山师范学院昆虫资源研发基地提供。

1.2 球孢白僵菌孢子悬浮液的配置

将供试菌种转接在PDA平板培养基上，在25℃、光周期12L∶12D的条件下培育至10 d，待大量产孢后，4℃保存备用。实验时，用滴管向PDA培养器（直径9 cm）中添加0.03%吐温80无菌水3～5 mL，然后用灭菌后的接种环刮取平板表面上孢子，每次刮取3～4个平板。将得到的菌液注入250 mL烧杯中并用磁力搅拌器搅拌40 min。待孢子全部散开后，再用双层医用方纱滤出菌液，得到孢子悬浮液母液。用血球计数器计数每毫升母液的分生孢子含量，然后用0.03%吐温80无菌水将其配制为1×10个/mL的供试孢子悬浊液。

1.3 普通齿蛉接菌方法

将普通齿蛉迅速置于底部直径10 cm、顶部直径12 cm、高8 cm的玻璃缸中，再用装满供试孢子悬浊液的自动喷雾器，将菌液喷至供试虫体表（每只试虫均匀喷洒）。当缸底菌液完全浸没虫体后，快速地把经过处理后的虫体置于底面垫有海绵的玻璃杯（底面口径10 cm、顶端口径12 cm、高9 cm），25℃、相对湿度85%培育，8 h后捡出死亡的虫体。

1.4 感染球孢白僵菌的普通齿蛉幼虫扫描电镜样品制备

每6 h在处理后的幼虫中选10头活虫，经3%戊二醛溶液固定过夜，再用PBS缓冲液浸洗3次，10 min/次；分别用50%、70%、80%、90%、100%乙醇逐层脱水，每级10 min，其间用100%乙醇脱水处理2次。用醋酸正戊酯置换2次，每次停留15 min。最后用CO临界点干燥2 h。取出试样，喷金（李庚午，1994）。在扫描电子显微镜（S-3400N，Hatachi）下观察并拍摄。

1.5 普通齿蛉幼虫感病症状

将30头普通齿蛉末龄幼虫用1.3中的接菌方法侵染。每12 h观察是否出现感病症状，记录感病症状以及死亡时间，统计各感病症状出现时间以及虫体数量。

1.6 普通齿蛉幼虫伤口侵染与拍照

将30头普通齿蛉末龄幼虫放入玻璃缸（长40 cm×宽20 cm×高10 cm）中使其互相打斗，每隔30 min观察1次，挑选出伤口在背部1～3腹节、长度为2～4 mm的试虫，每拿出1头虫就补充1头新虫。将20头受伤试虫平均分为2组，每隔24 h对其伤口进行拍照，观察并记录其恢复情况。其中1组使用供试孢子悬浮液侵染伤口（受伤后立刻侵染），用胶头滴管吸取供试孢子悬浮液，在每头虫伤口部位滴5滴，每隔24 h对其伤口进行拍照，观察并记录侵染与恢复情况。

因伤口脱水后会变形，无法进行电镜扫描，故使用LY-WN超清显微系统进行拍照。因拍照时需要杀死试虫，故无法选取同一只虫进行不同时间球孢白僵菌入侵状态的拍摄，所以选择伤口位置、大小尽量一致的不同试虫拍照。

2 结果与分析

2.1 球孢白僵菌侵染普通齿蛉幼虫体表的部位、时间和入侵方式

在普通齿蛉幼虫接种球孢白僵菌后，分生芽孢在节间膜处（图1：A）、体壁凹陷处（图1：B）、体壁管状凸起处（图1：C）、刚毛窝附近（图1：D，E）粘附；8 h后，分生孢子就已开始萌发并形成芽状凸起，继而形成芽管（图 1：F，G）；接种后 12 h内，已有较多芽管穿透幼虫的体壁（图1：H）；而接种18 h后，幼虫体表位于节间的分生孢子已经萌发侵入表皮（图1：H～L）。

图1 球孢白僵菌分生孢子在普通齿蛉幼虫体表的附着部位观察Fig.1 Attachment sites of Beauveria bassiana conidia on the body surface of Neoneuromus ignobilis larvae

球孢白僵菌对普通齿蛉幼虫的入侵主要包含了孢子粘附、萌发、透过体壁和细胞发育与繁殖等阶段。球孢白僵菌的分生孢子和试虫体表的接触与粘附并非单纯的物理接触，而是一个生物相互作用的过程，在普通齿蛉幼虫体表各个区域，球孢白僵菌的入侵也具有一定差别，一般分为2种方式：（1）通过芽管直接入侵：分生孢子吸水膨胀开始萌发，并在孢子的一端生成芽状凸起，萌发后直接入侵节间膜以及体表有缝隙的薄弱部位（图2：A）；（2）产生附着胞后进行入侵（图2：B，C）：这种情况一般是在体壁较厚的部位发生，分生孢子萌发后，伸出芽管沿体壁生长（图2：D），芽管生长过程中如遇适宜部位，则会生成附着胞向体壁入侵。接种后48～60 h，附着在体壁较厚部位如背部凸起等的孢子均萌发并侵入表皮（图2：E，F）；在接种96 h左右后，体表产生大量菌丝（图2：H，I）。

图2 分生孢子在普通齿蛉幼虫体表上不同部位的入侵Fig.2 Invasion of conidia on different parts of the body surface of Neoneuromus ignobilis larvae

同一时期侵染球孢白僵菌的普通齿蛉幼虫中，在体表节间膜部位的分生孢子首先萌发，而且比其他区域的芽管和菌丝更长，说明球孢白僵菌具有选择性地对虫体表皮侵染，因虫体薄弱环节为节间膜，所以球孢白僵菌侵染的部位也大多在此。

2.2 普通齿蛉幼虫感染球孢白僵菌后的感病症状

正常普通齿蛉幼虫在感染球孢白僵菌24 h时，10.00%出现反应迟钝、身体麻痹的症状；48 h时，76.67%出现反应迟钝的症状，且有少数死亡；72 h时，66.67%身体变柔软，这种症状持续时间最长（图3：A）；96 h时，死亡数量逐步增多，且虫体僵硬数量最多，占50.00%；感染108 h后，开始产生菌丝；感染120 h后，60.00%产生菌丝，此时死亡数量最大（83.33%）。带有伤口的普通齿蛉幼虫在感染球孢白僵菌后，死亡数量高峰比没有伤口的正常试虫提前约12 h，在108 h时，累计死亡数量达到总数的73.33%（图3：B）。带有伤口但未感染球孢白僵菌的试虫几乎不会因为受伤而死亡，除了伤口超过5 mm时因体内组织流出而死亡。

图3 普通齿蛉幼虫感染球孢白僵菌感病的反应（A）与死亡数（B）Fig.3 Response(A)and mortality(B)of Neoneuromus ignobilis larvae challenged by Beauveria bassiana

2.3 普通齿蛉幼虫伤口感染球孢白僵菌后的感病症状

接菌后24 h内，试虫的外表和对触碰的反应与正常虫体均无差别（图4：A，B）；48 h后，反应迟钝、麻痹；72～120 h后，开始死亡，刚死去时躯体柔软，但随后身体渐渐僵硬，且随着时间推移死亡率逐步上升。部分刚死去的虫体表面被密集生长的白色菌丝所掩盖，而部分虫体表层未见菌丝，但伤口部位有明显的菌株且凸起明显（图4：C，D），与未感染球孢白僵菌的伤口有很大差异。

图4 普通齿蛉幼虫感染后的伤口愈合情况Fig.4 Wound healing of Neoneuromus ignobilis larvae after infection

2.4 普通齿蛉幼虫伤口愈合情况

普通齿蛉幼虫打斗受伤后24 h，伤口不再有液体流出并开始结痂（图5：A）；48 h后，伤口黑色变淡，并开始出现1层半透明薄膜（图5：B）；72 h后，伤口逐渐恢复，凹陷逐渐减轻（图5：C）；120 h后，伤口几乎复原，只有受伤后的痕迹和1个很小的黑色疤痕（图5：D）。这类伤口在恢复期几乎全是凹陷，随着时间推移，伤口逐渐平整。

图5 普通齿蛉幼虫的伤口愈合情况Fig.5 Wound healing of uninfected Neoneuromus ignobilis larvae

3 结论与讨论

本研究结果和之前的研究都表明节间膜是虫生真菌侵入的主要部位（张爱文等，1994；王晓红等，2009；邓彩萍等，2012），这可能是因为节间膜较薄，有利于菌丝的穿透。球孢白僵菌孢子在各种幼虫虫体表面平缓的体壁区产生附着胞，而有的则以粗度和菌丝大小一致的芽管形式进入，进入后还带有主动寻求适合侵染位点的功能，在不适合的体表部位又进行了平行繁殖，直到遇到适合的侵染位点才发生侵染，说明球孢白僵菌对进入普通齿蛉幼虫的表皮部位存在一定的选择性，这或许与各个部位的表面构造不同有关。研究结果表明，正常虫体分生孢子萌发的时间大约为12 h，在24 h左右时，大部分分生孢子侵入虫体，感染伤口的普通齿蛉幼虫与感染正常虫体的试虫死亡时间提前约12 h。在伤口的位置，球孢白僵菌侵入速度更快，可能是与伤口部位较为粗糙、适合分生孢子的附着，以及不需要再寻找较薄的表皮即可侵入虫体有关。

应用球孢白僵菌进行生物防治时发现，昆虫虫龄越小，越易感病（季香云，杨长举，2003；仝亚娟等，2010；贺然等，2020）。普通齿蛉生活史较长，可达1～2年（刘星月，2008），易成为白僵菌的寄主。学者对球孢白僵菌侵染昆虫寄主过程的研究一般着眼于如何杀灭昆虫，用于生物防治，且研究对象多为陆生昆虫（王晓红等，2008；王龙江等，2010；王雅卉等，2011；张艳梅等，2011；曹庆杰等，2015；申宇等，2018；刘忱，郭志红，2019），但旨在避免球孢白僵菌侵染昆虫（尤其是水生昆虫），从而提高资源昆虫养殖成活率的研究鲜有。本文选取具有代表性的水生资源昆虫——普通齿蛉为研究对象，研究了球孢白僵菌侵染正常试虫体表和伤口的过程和感病情况，对降低普通齿蛉人工养殖过程中因球孢白僵菌侵染而造成的死亡提供了理论依据，也丰富了球孢白僵菌侵染不同生态类型昆虫的研究。