代谢工程改造大肠杆菌生产柠檬酸

韩雪影,李 露

(青岛科技大学a.海洋科学与生物工程学院;b.化工学院,山东 青岛266042)

柠檬酸又名枸橼酸,其分子式为C6H8O7,外观呈白色结晶性粉末、白色颗粒或者是无色半透明晶体[1],可用作防腐剂、增味剂、螯合剂、p H 调节剂、抗氧化剂和稳定剂等[2],在食品、化工、纺织、环保、医药、化妆品等行业有着广泛的用途[3-4]。

已经有许多微生物被报道能够生产柠檬酸,包括细菌[5-7],霉菌[8-9]和酵母[10-12]等,但工业生产菌主要为黑曲霉和酵母菌。目前黑曲霉是工业中最常用的柠檬酸发酵菌株,但黑曲霉生长缓慢,发酵时间长,菌体形态不易控制,发酵时需富氧通气等本身缺陷不易改变,因此寻求其他微生物用于柠檬酸发酵,酵母菌生长快速、无需富氧发酵,菌体形态不易变形,但发酵后副产物较多,遗传改造困难,与黑曲霉相比柠檬酸产量较低。本课题利用代谢工程改造的大肠杆菌进行发酵,大肠杆菌生长快速、易于遗传改造,无需富氧发酵,且大肠杆菌W 耐酸性较好,适合用于有机酸的生产。

在大肠杆菌中柠檬酸和衣康酸的代谢途径极为相似,glt A基因和cad基因分别是柠檬酸和衣康酸生产的关键酶,glt A基因是衣康酸合成代谢途径中的一环,二者的区别在于有无cad基因的表达[13];cad基因在代谢途径中跟柠檬酸的生产毫无关系,但在代谢工程改善衣康酸的生产过程中,glt A基因经常被过表达以增加衣康酸的生产且效果明显。如:通过自组装技术,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中过表达了基因cad、glt A和ACN(乌头酸酶),使衣康酸的产量得到了提高[14]。HARDER 等[15]以大肠杆菌MG1655 为宿主过表达了cad、glt A等基因,获得了工程菌生产衣康酸的最高产量。但是cad基因的过表达对柠檬酸的代谢过程到底有何影响,却很少有文献报道。本研究在大肠杆菌W 中单独过表达glt A基因和共表达glt A、cad基因,筛选获得wg和wgc工程菌,通过摇瓶发酵对比柠檬酸产量,探索cad基因在大肠杆菌中过表达对柠檬酸产量的影响,为阐明柠檬酸和衣康酸代谢途径之间的联系奠定基础。后续通过单因素试验探索碳源、初始糖含量、温度、p H、接种量和外源添加酵母膏等发酵条件对柠檬酸生产的影响。

1 实验部分

1.1 菌株、质粒与引物

使用菌株DH5α为克隆宿主,大肠杆菌W(ATCC 9637)为表达宿主,所用质粒为p CDFduet-1和p COLAduet-1,引物序列列于表1。cad基因序列来源于土曲霉(NCBI序列ID:BAG49047.1),由上海生工生物有限公司全基因合成并进行密码子优化;glt A基因序列来源于大肠杆菌W(NCBI序列ID:945323),从本实验室已有菌株中扩增获得。启动子(tac和BBa_J23100)和终止子(BBa_B1001)的序列可从标准生物学部分注册处(http://parts.igem.org)获得。5＇UTR 由UTR 设计网站设计(http://sbi.postech.ac.kr/utr_designer)[16]。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primers sequence

1.2 重组菌株wg和wgc的构建

使用Prime STAR(Takara)高保真酶,以带有目的基因片段的质粒为模板,通过PCR 扩增目的基因片段,以原始质粒载体为模板,通过PCR 扩增载体片段。对回收纯化后的基因片段和载体片段分别进行双酶切,然后在T4连接酶(Takara)的作用下连接基因片段与质粒片段,分别构建基因表达载体。具体如下:

1)将glt A基因片段取代p COLADuet-1 质粒上T7启动子至终止子之间的片段,并使用启动子元件PBBa_J23100启动表达和终止子元件Ter BBa_B1001终止表达,启动子和终止子通过引物设计加入到基因的两端,构建重组质粒p COLA-glt A(图1(a))。最后将构建好的重组载体p COLA-glt A(图1(a))通过热激法转化大肠杆菌W,获得重组菌株wg。

2)用cad基因片段取代p CDFDuet-1 质粒上T7启动子至终止子之间的片段,并使用启动子元件tac启动表达和终止子元件Ter BBa_B1001 终止表达,构建重组质粒pCDF-cad(图1(a)),最后将构建好的重组载体p CDF-cad(图1(b))通过热激法转化大肠杆菌wg,获得重组菌株wgc。

图1 重组质粒pCOLA-gltA 和pCDF-cadFig.1 Recombinant plasmid pCOLA-glt A and p CDF-cad

1.3 培养基和培养条件

将阳性重组菌株用LB培养基(10.0 g·L－1胰蛋白胨、5.0 g·L－1酵母提取物和5.0 g·L－1NaCl)在37 ℃和150 r·min－1条件下培养12 h,然后按照4%的接种量接种至M9 培养基(12.8 g·L－1Na2HPO4·7H2O、3 g·L－1KH2PO4、0.5 g·L－1NaCl、1.0 g·L－1NH4Cl、0.5% 葡 萄 糖、2 mmol MgSO4、0.1 mmol CaCl2)[17],在37℃和200 r·min－1下生长至OD600值约为1.0 时,加入0.2 mmol·L－1IPTG 诱导蛋白的表达,最后在37 ℃,200 r·min－1条件下发酵96 h后收集发酵液。

1.4 分析方法

通过检测发酵液在600 nm 处的光吸收来衡量菌体的生物量。利用HPLC 检测发酵液中的柠檬酸和蔗糖[18]。色谱柱使用Aminex HPX-87 H 有机酸柱(25.0 cm,0.4 cm i.d.,Bio-Rad),流动相为5.0 mmol·L－1H2SO4,分析条件为:RID 检测器,流速0.4 m L·min－1,柱温65 ℃,进样体积为10.0μL。

2 结果与讨论

2.1 基因glt A 和cad 对柠檬酸产量的影响

glt A(柠檬酸合酶基因)是柠檬酸合成不可或缺的基因,而cad基因的过表达从理论上来说能加速柠檬酸的消耗,使柠檬酸的含量降低,为了探索基因cad对柠檬酸产量的影响,将重组菌株wg、wgc于37 ℃,150 r·min－1条件下用LB培养基培养12 h,然后在4%的接种量,37 ℃,200 r·min－1条件下用M9培养基发酵5 d,以进行产量的对比。野生菌W 在相同条件下发酵,在发酵液中检测不到柠檬酸,因此默认本实验中野生菌不产柠檬酸,在此条件下进行数据处理和实验分析,见图2。第1 d开始wg和wgc表达菌株发酵液中柠檬酸的含量呈逐渐上升的趋势,发酵到第4 d时柠檬酸含量达到最高,wg最高产量为150 mg·L－1,wgc最高产量为245 mg·L－1。第4 d之后柠檬酸含量开始下降,可能由于发酵液中糖分的消耗使得碳源通量降低。在相同时间点,菌株wgc柠檬酸的生产量全都高于wg菌株柠檬酸的产量,1～5 d wgc柠檬酸产量与wg柠檬酸产量的比值分别为2.5、1.9、1.8、1.6、2.1,wgc表达菌株生产柠檬酸的能力明显比wg菌株更好,这表明cad基因的过表达有利于柠檬酸产量的提高,可能是因为cad基因的过表达进一步诱发或抑制了大肠杆菌机体内柠檬酸相关的其它代谢途径,导致柠檬酸的积累。

图2 wg和wgc发酵生产柠檬酸Fig.2 Fermentation of wg and wgc to produce citric acid

2.2 发酵条件的优化

2.2.1 不同碳源对柠檬酸产量的影响

为了探索不同碳源对重组菌株wgc发酵生产柠檬酸的影响,将共表达cad、glt A的菌株在4%的接种量,37 ℃,200 r·min－1条件下分别置于4 g·L－1的蔗糖、葡萄糖、果糖和麦芽糖中发酵培养4 d,结果见图3。以蔗糖为碳源进行发酵所得发酵液中柠檬酸含量最高,明显优于其它糖类,达到0.63 g·L－1,柠檬酸产量提高了152%。使用果糖和麦芽糖作为碳源发酵柠檬酸含量较低,使用二糖发酵比单糖产量略高,因此确定二糖中的蔗糖为最适发酵碳源,并使用蔗糖进行后续发酵试验。

图3 碳源对柠檬酸产量的影响Fig.3 Effect of carbon source on the yield of citric acid

2.2.2 蔗糖浓度

底物蔗糖浓度对大肠杆菌的生长和柠檬酸的合成有着不可忽视的影响。蔗糖浓度过高会造成渗透压高,发酵液黏度相应增加,从而影响传质速率,造成菌体生长延迟期的延长和比生长速率的降低,影响柠檬酸的合成速度。合适的糖浓度使柠檬酸产量高,残糖低,糖酸转化率高。将重组菌株wgc在4%的接种量,37 ℃,200 r·min－1条件下分别置于2、4、6、8 g·L－1的蔗糖中摇瓶96 h,考察蔗糖浓度对柠檬酸产量的影响见图4。从图4可看出,随着蔗糖浓度的提高,柠檬酸产量逐渐增加,在蔗糖浓度8和10 g·L－1时获得柠檬酸含量分别为1.36 和1.37 g·L－1,柠檬酸产量提高了约117%,但蔗糖的利用率较低,分别为24.4%和13.7%,为了减少碳源浪费,降低生产的成本,综合考虑柠檬酸产量和蔗糖的利用率之后,选用8 g·L－1的蔗糖浓度进行发酵。

图4 蔗糖浓度对柠檬酸产量的影响Fig.4 Effect of sucrose concentration on the yield of citric acid

2.2.3 发酵温度

温度影响着菌体的生长以及机体内各种反应的进行,菌体最佳生长温度和最佳发酵温度可能有所不同,为了探索大肠杆菌发酵生产柠檬酸适宜的发酵温度,将重组菌株wgc置于4%接种量、8 g·L－1蔗糖、200 r·min－1和温度分别为25、30、35、40和45℃条件下发酵培养96 h,结果见图5。温度在25～35 ℃之间时,发酵液中柠檬酸含量呈现出随温度的升高而逐渐上升的趋势,超过35℃后柠檬酸含量则逐渐下降,在35 ℃时柠檬酸含量最高,为1.37 g·L－1,柠檬酸产量提升不明显。35℃与37℃柠檬酸产量差别甚微,考虑到已经在发酵初期通过37℃发酵来提高生物量,选择37℃作为后续工程菌生产柠檬酸的发酵温度。

图5 温度对柠檬酸产量的影响Fig.5 Effect of temperature on the yield of citric acid

2.2.4 p H

为了探索培养基初始p H 值对发酵生产柠檬酸的影响,考察了4%接种量、8 g·L－1蔗糖、200 r·min－1、37 ℃和p H 6.0～8.0 时柠檬酸的含量,见图6。由图6所示,p H 在6.0～7.0的范围内,p H的变化和柠檬酸产量变化呈正相关,当p H 为7.0时,柠檬酸产量最高为1.41 g·L－1,产量与不控制p H 相比提升3%,p H 7.0～8.0时,柠檬酸呈下降趋势,p H 为6.0 和8.0 时,柠檬酸产量较低,可能由于在酸性和碱性环境中影响大肠杆菌细胞的生长,为获得较高柠檬酸产量,选择p H 7.0进行后续发酵实验。

图6 p H 对柠檬酸产量的影响Fig.6 Effect of p H on the yield of citric acid

2.2.5 接种量

接种量是影响发酵的重要因素之一,一般来说接种量越大,起酵时间越短,降糖速率越高,也会导致菌体过快衰老,较低的接种量会使发酵过程缓慢,为了寻找合适的接种量,将重组菌株置于8 g·L－1蔗糖、200 r·min－1、温度37 ℃、p H 7.0和接种量分别为2、4、6、8、10%的条件下发酵96 h,结果见图7。如图7所示,在接种量为2%和4%时,柠檬酸产量较高,在接种量4%时柠檬酸产量达到了最高为1.42 g·L－1,随后产量快速下降,可能由于菌量过多,使蔗糖消耗过快,细胞内碳通量下降,柠檬酸产量随之下降。根据以上结果,选择4%接种量进行柠檬酸后续的发酵实验。

图7 接种量对柠檬酸产量的影响Fig.7 Effect of inoculation amount on the yield of citric acid

2.2.6 外源添加酵母膏量

为了探究有机氮源酵母膏对发酵的影响,将重组菌株wgc置于4%接种量、8 g·L－1蔗糖、200 r·min－1、温度37 ℃、p H 7.0和酵母膏含量分别为0、1、2、3 g·L－1的条件下发酵96 h,结果见图8。如图8所示,外源添加酵母膏2 g·L－1时,获得最高柠檬酸产量为0.26 g·L－1,但远远低于不添加酵母膏时柠檬酸的产量,原因可能是发酵生产柠檬酸时,大肠杆菌偏好吸收无机碳源,有机碳源的增加延长了菌群生长的时间,降低了产酸的效率,因此酵母膏的加入不利于柠檬酸产量的提高。综上所述,单因素试验确定的最佳发酵条件为蔗糖8 g·L－1、接种量4%、温度37 ℃、p H 7.0。

图8 酵母膏添加量对柠檬酸产量的影响Fig.8 Effect of the added amount of yeast extract on the yield of citric acid

2.2.7 发酵时间

在接种量4%、蔗糖8 g·L－1、温度37 ℃、p H 7.0的条件下进行摇瓶发酵5 d,结果见图9。第4天获得最高柠檬酸产量为1.44 g·L－1,与优化前相比柠檬酸产量提高了6倍左右。

图9 发酵时间对柠檬酸产量的影响Fig.9 Effect of time on the yield of citric acid

3 结 论

1)构建了生产柠檬酸的工程菌wg和wgc,实验结果表明cad基因的过表达同样也是增强工程菌柠檬酸合成的有效手段,可能是由于cad基因的过表达是加快了柠檬酸消耗,而柠檬酸作为三羧酸循环中重要的一环,含量过低影响菌体正常代谢,因此cad基因的过表达可能加快了三羧酸循环速率,增加了柠檬酸的通量。

2)确定了工程菌wgc生产柠檬酸的发酵工艺参数:将单菌落在LB培养基中37℃、200 r·min－1下培养12 h,然后以4%接种量接种至含有8 g·L－1蔗糖、p H 为7.0的M9培养基中18 ℃低温诱导24 h,然后转至37 ℃发酵96 h后获得了最高柠檬酸产量为1.44 g·L－1。