酒石酸亚铁- 标准曲线法对沙棘茶中茶多酚含量的测定

杨若熙 王贝* 刘桂艳

（武汉华夏理工学院生物与制药工程学院，湖北武汉 430223）

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.），是胡颓子科沙棘属落叶性灌木，沙棘叶中富含大量的多酚、黄酮、萜类化合物，因此具有较好的医药价值和保健价值[1]。根据研究，沙棘是一种潜在的抗氧化剂物质，可以延缓许多与自由基相关的疾病[2]。茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称，具有强效杀毒和抗菌作用，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、DNA病毒及RNA病毒都具有抑制其活性的作用。且茶多酚无毒副作用、对机体无刺激[3]。茶多酚的组成一般有表儿茶素与表没食子儿茶素类, 因为儿茶素结构中的氢氧基团在苯核中的位置不同,会形成邻苯二酚基、连苯三酚基,，还有没食子酸的酯型结合物，所以也可采用酒石酸亚铁- 标准曲线法计算沙棘茶叶中茶多酚的浓度[4]。其主要作用原理是酒石酸亚铁溶液能与茶多酚中的邻连位羟基官能团发生显色反应，而对间位羟基和单羟基不发生显色反应，反应后形成紫褐色配位化合物，在可见光区有特定的波长吸收。酒石酸亚铁比色法具有反应快速、精密性高、操作简便等特点，用此方法对沙棘茶叶中茶多酚进行含量测定，为沙棘资源的开发利用提供依据。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

沙棘茶叶，购自中国新疆先农伯益生物科技技术公司；没食子酸，国药集团化学试剂有限公司；L- 酒石酸钾钠四水合物、七水合硫酸亚铁、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾，国药集团化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯。

FA214 型电子天平，上海海康电子仪器厂；UV-1200型紫外可见分光光度计，翱艺仪器（上海）有限公司；HH-2数字显示恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司；TU-1900 紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，巩义市子华仪器有限责任公司。

1.2 标准液的制备

精密称取0.110 6g没食子酸标准品，加蒸馏水适量，搅拌溶解至溶液澄清后转移至100mL 容量瓶中定容至100mL，摇匀，即得1 mg/mL没食子酸标准溶液[6]。

精密称取0.101 0gFeSO4·7H2O 、0.500 5g四水合酒石酸钾钠，加蒸馏水适量，经充分搅拌溶解后转移至100mL容量瓶中定容至100mL，摇匀，即得黄绿色酒石酸亚铁溶液。

精密称取23.337 0gNa2HPO4·12H2O，加蒸馏水后快速搅拌，溶解后转移至1000mL容量瓶中定容即得磷酸盐A液，称取KH2PO40.907 8g，同理，转移至100mL 容量瓶中定容即得磷酸盐B液，将所得磷酸盐A液、B液按配比取不同体积混匀后，即得不同pH 的磷酸盐缓冲溶液。

1.3 供试液的制备

称取5g沙棘茶叶置于250mL圆底烧瓶中，加入沸蒸馏水150mL，于90℃水浴中浸提40min，浸提结束后趁热进行减压抽滤，弃去滤渣，将滤液转移至棕色试剂瓶中，等待冷却。

1.4 茶多酚含量测定条件的优化

1.4.1 最大吸收波长的确定。精密量取1 mg/mL没食子酸标准液0、0.75、1.00、1.25mL 置于25ml 具塞比色管中，用酒石酸亚铁比色法测定[5-6]。依次添加4mL蒸馏水、5mL酒石酸亚铁溶液、用pH=7.5 的磷酸盐缓冲液定容至刻度，振摇多次使其混匀，以不加没食子酸标准溶液组作为对照，在400-800nm检测确定该溶液的最大吸收波长。

1.4.2 单因素实验。选取3 个主要干扰因素分别开展单因素实验。固定各主要干扰因素含量值不变的反应条件下，探究蒸馏水用量（2、4、6、8、10mL），酒石酸亚铁溶液用量（1、3、5、7、9ml）,磷酸盐缓冲液pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）三个因素对茶多酚含量测定值的影响，以吸光度为主要评价指标筛选出各主要干扰反应因素的最优反应条件。

1.4.3 正交实验。根据上述单因素实验结论，以茶多酚含量测定的最优反应条件组合为重点考察指标，选择蒸馏水用量（A）、酒石酸亚铁溶液用量（B）、磷酸盐缓冲液pH(C)作为考察因素[7]，进行L9(34)正交实验。

1.4.4 线性关系的考察。取其在最大吸收波长处的最大吸收波长值，依次测定溶液吸光度（A）。以含没食子酸标准品组浓度（C, μg/mL）为曲线的横坐标，吸光度（A）为曲线的纵坐标，绘制标准曲线。

1.5 酒石酸亚铁- 标准曲线法测定茶多酚

1.5.1 沙棘茶中茶多酚的含量测定。用移液管吸取棕色试剂瓶中待测溶液1mL至25mL具塞比色管中，再添加蒸馏水4mL、酒石酸亚铁溶液5mL，用ph=7.5 的磷酸缓冲液定容至刻度,盖上盖子，振荡摇匀。以不含茶多酚组做空白对照，在540nm 处测定其吸光度（A），将测定结果代值入1.4.4 节中所绘制的标准曲线中，可计算其待测样品中茶多酚含量[8]。

1.5.2 精密性实验。称取5g干燥沙棘茶叶，按1.3 节方法制备供试品溶液，用酒石酸亚铁- 标准曲线法对供试品溶液进行茶多酚含量测定，重复5 次测定实验，求出沙棘茶叶中茶多酚的含量，计算相对标准偏差(RSD)。

1.5.3 稳定性实验。用酒石酸亚铁- 标准曲线法对供试品待测液进行稳定性实验，量取一定体积的供试品液于具塞比色管中，按1.4.3 节所示最优反应组合添加试剂，每间隔一段时间检测一次，检验时间(min)对吸光度（A）的影响。

1.5.4 加标回收实验。取相同体积供试液，分别加入质量分数为供试液80%、100%、120%的没食子酸，用酒石酸亚铁- 标准曲线法测定吸光度，重复3 次实验操作，以求得加标后回收率。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1 蒸馏水用量的影响。在恒定酒石酸亚铁溶液用量、磷酸盐缓冲液pH 的情况下，改变蒸馏水用量，由于体系内磷酸盐缓冲液的存在，使溶液pH 长期处在相对平衡的状态，但随着蒸馏水用量变化的进一步增加，溶液吸光度已无显著改变。因此，可首先根据具塞比色管定容所需体积再选取蒸馏水用量，故选择4mL蒸馏水为实验测定条件。

2.1.2 酒石酸亚铁溶液用量的影响。在其余单因素条件恒定的情况下，改变酒石酸亚铁溶液用量对吸光度（A）变化有显著的影响，其影响规律结果见图1 所示。酒石酸亚铁溶液作为反应的显色剂，当其溶液用量较不足时，吸光度变化较为不明显；相反，当酒石酸亚铁溶液用量逐渐增加时，吸光度（A）呈现急剧上升的态势；由此可得，显色剂在反应中作用较为重要。然而当显色剂溶液用量大于5mL时，吸光度（A）逐渐呈现稳定地态势。由于含酒石酸亚铁溶液的溶液组分物中含有金属亚铁离子，在微碱性溶液介质中会较易发生氧化, 同时过量经稀释所得的含酒石酸亚铁的酸性溶液浓度也可能会由此造成对实验研究结果、所得测定数据中吸光度产生间接干扰，故选择5mL酒石酸亚铁溶液为实验测定条件。

图1 酒石酸亚铁溶液用量的影响

2.1.3 磷酸盐缓冲液pH 的影响。磷酸盐缓冲液pH 对吸光度（A）的影响结果见图2 所示。可知，缓冲液为溶液中定容的溶液，整个反应体系的主要反应介质，影响整个体系的pH 值。pH 的变化对与Fe2+形成蓝紫色配位化合物有较大影响。由图2 可知，吸光度随pH 的增大而增大。按照光度误差的要求，测定的吸光度，应该在0.2～0.8 的范围内。由于pH＞8.0 的溶液体系会引起茶多酚化合物氧化的进一步氧化，而pH=7.5 时反应较为稳定，所以选择实验测定条件的磷酸盐缓冲液为pH=7.5。

图2 磷酸盐缓冲液pH 的影响

2.2 正交实验结果分析

表1 和表2 为正交实验结果和方差分析结果。极差值（R）越大，该因素的水平变动对实验的影响越大，由表2 可知，三因素对沙棘茶中茶多酚的含量测定影响的顺序是磷酸盐缓冲液（C）＞酒石酸亚铁溶液用量（B）＞蒸馏水用量（A）。由表3 可知，三因素对沙棘茶中茶多酚含量测定的影响只有磷酸盐缓冲液有显著性差异（P＞0.1）。综上所示，根据2.1 节中所述单因素水平试验的结论，综合考虑最优反应条件组合为A2B2C2，即蒸馏水4mL、酒石酸亚铁溶液5mL、pH7.5 的磷酸盐缓冲液[9]。

表1 正交实验结果

表2 正交实验方差分析结果

2.3 方法验证结果

2.3.1 最大吸收波长与线性关系。图3 所示为在其他干扰因素水平恒定的条件下，加入不同体积的没食子酸标准溶液液的可见光吸收曲线。由图3 中可得知：由于没食子酸溶液加入体积量的增大，溶液中没食子酸的含量增加，最大吸收波长（λ） 也略增大，测定的最大吸收波长为538-540nm，相对稳定。因此，选择540nm进行测定。

根据1.4.4 节中所述方法，求得含没食子酸标准品溶液的线性回归标准曲线方程式为：Y=0.0184X+0.0186(r=0.9997)。没食子酸标准曲线见图3，结果表明在10-50μg/mL内具有良好的线性关系。

图3 可见光吸收光谱图

2.3.2 精密性。精密性的相对标准偏差（RSD）可接受限度一般为2.0%，表3 为酒石酸亚铁- 标准曲线法的精密性测定实验结果。由表3 可知：酒石酸亚铁- 标准曲线法测定沙棘茶中茶多酚的含量精密性的RSD在可接受范围内。

表3 酒石酸亚铁- 标准曲线法的精密性

2.3.3 稳定性。酒石酸亚铁- 标准曲线法有较好的稳定性，由于稳定性实验过程所需要时间较长，没食子酸和酒石酸亚铁发生进一步的氧化，随着时间（t）的增加，吸光度呈现微小的降低趋势，所以实验所需溶液需要现配现用后直接检测。

2.3.4 加标回收率。酒石酸亚铁- 标准曲线法测定茶多酚含量的加标回收率实验结果见表4。由此可知，加标回收率结果在回收率限度内。

表4 酒石酸亚铁- 标准曲线法的加标回收率实验

3 结论

沙棘具有生态效益、社会效益与经济效益，且沙棘茶叶中含有丰富的茶多酚，具有很高的开发利用价值。酒石酸亚铁- 标准曲线法可有效测定出沙棘茶叶中的茶多酚含量，其含量为1.51mg/g，其基本原理是酒石酸亚铁溶液作为显色剂与茶叶提取液中茶多酚发生显色反应，得到较为稳定的深紫褐色络合物，且反应后溶液颜色的深浅与溶液中茶多酚的含量成正比关系。该法是用无水没食子酸为标准品配置对照品溶液，以酒石酸亚铁作为反应的显色剂，方法精密度高、稳定性强、操作简便，最佳的测定条件组合是蒸馏水4mL、酒石酸亚铁5mL、pH=7.5 的磷酸盐缓冲液。用本法进行茶多酚的含量测定操作简单，线性范围宽，易于推广使用。