甜瓜SnRK2 基因家族的鉴定与特征分析

刘成功，李 壑，韩子超，苏婷婷，张月洋，张 尧，李忠晴，王爱英，祝建波

（石河子大学 生命科学学院 农业生物技术重点实验室，新疆 石河子 832061）

在逆境如干旱、寒冷、高盐和氧化等这些不利因素下，植物的基因表达发生改变，会关闭一些正常表达的基因，启动一些与逆境相适应的基因[1]，改变次级代谢产物、诱导新蛋白质与酶的形成等，这是植物在不断进化过程中形成的一套应对各种环境刺激的机制[2]。

植物蛋白激酶在信号转导中起着重要的作用，其中一些是植物所独有的。钙依赖蛋白激酶（CDPK）家族是植物中最大的激酶家族之一，在拟南芥中与CDPK 和SnRK（SNF1 相关激酶）相关的激酶组成CDPK-SnRK 超家族，其通过改变蛋白质的磷酸化和去磷酸化状态，调控下游相关基因的表达，启动相应的程序[3]，从而对生物的生长发育起到重要的调控作用。由于编码这些蛋白质家族的基因在逆境中具有积极的调节作用，特别是干旱和盐胁迫[4]，因此，常作为植物抗病育种和遗传改良的潜在候选基因。其中SnRK（蔗糖非发酵型蛋白激酶家族）是一类植物内特异性的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶[5]，该基因家族在进化上高度保守，在植物中广泛存在，是植物生长发育和胁迫应答调控网络的枢纽[6]。SnRK 根据核酸和蛋白质序列的相似性可以分为SnRK1、SnRK2、SnRK3 三个亚家族[7]。其中SnRK1与哺乳动物AMPK和酵母SNF1基因同源，主要参与碳代谢和能量代谢[8-9]。而SnRK2 和SnRK3是植物特有的蛋白激酶亚家族[10]，其中，SnRK2又可以进一步分为SnRK2aⅠ、Ⅱ亚族（富含谷氨酸）和SnRK2b Ⅲ亚族（富含天冬氨酸）[11]，在非生物逆境应答、ABA 信号转导和发育过程中具有重要功能[12-13]。当ABA 受体与ABA 结合后，增强了ABA 受体与PP2C 结合，此时SnRK2 基因与PP2C 分离，当SnRK2 与PP2C 结合时，SnRK2 基因处于非磷酸化状态，它不能激活下游参与植物抗逆的相关基因，只有磷酸化状态的SnRK2 才能激活下游相关抗性基因表达[14-16]。

甜瓜属葫芦科甜瓜属，为雌雄同株1 年生蔓性草本植物，是一种重要的经济作物。我国甜瓜栽培总面积和产量都居世界首位[17]，然而在甜瓜生长周期中经常会受到各种逆境胁迫的影响，如病原菌侵染、盐胁迫、旱胁迫等，这些逆境胁迫都会对甜瓜的品质和产量产生不良影响。SnRK2 作为植物逆境信号调控网络的枢纽，在甜瓜的抗逆过程中扮演着重要角色。目前为止，多种植物中的SnRK2 基因已被分离鉴定，但是对于甜瓜SnRK2 基因的相关研究还鲜见报道。因此，以甜瓜基因组为基础，对甜瓜SnRK2 基因家族进行系统的鉴定和特征分析，为今后探讨甜瓜的遗传进化和抗逆提供一定的基础。

1 材料和方法

1.1 甜瓜SnRK2基因家族成员的鉴定与理化分析

使用拟南芥SnRK2 蛋白序列作为查询序列，在甜瓜数据库中进行BLASTP 搜索，以鉴定甜瓜基因组中的SnRK2 成员，并利用在线网站SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de）对搜索得到的序列进行保守结构域分析和进一步鉴定。

利用在线软件ProtParam（https://web.expasy.org）计算SnRK2 蛋白的分子质量（MW）和等电点（pI），利用Wolfpsort（https://www.genscript.com）预测SnRK2 家族成员的亚细胞定位，利用SOPMA（https：//prabi.ibcp.fr/htm/）在线工具预测蛋白质的二级结构。

1.2 SnRK2基因家族进化树的构建

在Phytozome 数据库搜索下载玉米、拟南芥、黄瓜和水稻的SnRK2 基因蛋白质序列，利用ClustalW软件进行序列比对，利用MEGA 7.0 软件构建系统进化树，校验参数为1 000次重复，其他值为默认。

1.3 甜瓜SnRK2基因家族成员的基因结构和保守结构分析

利用在线软件GSDS 2.0（https://gsds.cbi.pku.edu.cn）对玉米、水稻、拟南芥、黄瓜、甜瓜SnRK2 的基因结构进行分析；利用在线软件MEME（https://meme-suit.org）对其蛋白质序列的保守结构域进行分析，最大结构域数目设置为15。

1.4 甜瓜SnRK2基因家族的染色体定位

从Esemble Plant 数据库中下载甜瓜、黄瓜、拟南芥、水稻、玉米的基因组信息和注释文件，利用TBtools 软件对甜瓜SnRK2 基因家族的染色体定位进行可视化。

1.5 甜瓜SnRK2基因家族成员启动子顺式作用元件分析

使用TBtools 软件从甜瓜基因组序列文件中提取甜瓜SnRK2 基因家族成员起始密码子上游2 000 bp 的DNA 序列，使用在线软件plantCARE（https:bioinformatics.psb.ugent.be）分析启动子中的顺式作用元件。

1.6 甜瓜SnRK2基因家族成员表达特性分析

从Melonet DB 数据库（https://melonet-db.dna.affrc.go.jp）中获取甜瓜SnRK2 基因家族成员在不同组织中的转录组数据，并将所得表达量数据RPKM（Reads per kilobase per million mapped reads）经log2（X+1）处理后使用TBtools软件进行热图绘制。

2 结果与分析

2.1 甜瓜SnRK2基因家族成员的鉴定与理化性质分析

在甜瓜数据库中进行BLASTP 比对，将下载获得的蛋白质序列使用NCBI 和在线网站SMART 同时检查是否含有SnRK2 蛋白特有的保守结构域，最终共获得9 个SnRK2 家族成员，根据其染色体分布情况，将其命名为CmSnRK2-1—CmSnRK2-9。SnRK2家族成员的激酶结构域中含有2个特殊的位点。第1 个是含有核苷酸结合域标志I/LG/NXGXFG/AXA/V 和作为ATP 结合位点的赖氨酸残基的ATP 结合区，第2 个是由具有质子受体活性的天冬氨酸残基（活性位点）的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点标志V/ICHRDLKLENTLL 组成[18]。如图1所示，CmSnRK2-3和CmSnRK2-6无位点1，其他7个成员均具有2个位点。

图1 甜瓜SnRK2蛋白序列比对的2个特殊位点序列信息Fig.1 Sequence information of two special sites of SnRK2 protein sequence alignment in melon

甜瓜SnRK2 基因家族的理化分析结果如表1所示。甜瓜SnRK2 蛋白氨基酸长度为281～654 aa，分子质量为31.49～75.02 ku，等电点为4.42～6.21，其中CmSnRK2-2的等电点偏中性，其他的均为酸性。亚细胞定位预测结果显示，CmSnRK2-2定位在内质网，CmSnRK2-3定位在细胞质，CmSnRK2-5定位在细胞核，CmSnRK2-7定位在过氧物酶体，其余5 个成员定位在细胞骨架中。此外，表2 显示，甜瓜SnRK2基因的二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲组成，二者在蛋白质中的比例约占氨基酸数目的79%，而延伸链和β-转角的比例仅占15%和6%左右。

表1 甜瓜SnRK2基因家族成员的理化性质Tab.1 Characteristics information of SnRK2 genes in melon

表2 甜瓜SnRK2基因的二级结构Tab.2 Secondary structure of SnRK2 genes in melon %

2.2 SnRK2系统进化分析

为研究植物SnRK2 基因家族成员的系统进化关系，采用邻接法对拟南芥（10个）、玉米（11个）、水稻（10 个）、黄瓜（11 个）、甜瓜（9 个）的SnRK2 蛋白构建系统进化树（图2），SnRK2 基因家族的亚家族成员的功能分类与其受逆境的诱导情况有很大的关系，例如，拟南芥SnRK2 基因家族根据其受ABA激素诱导的不同可以分为两大部分，其中5 个基因受ABA 强 烈 诱 导[AT3G50500.2（AtSnRK2.2）、AT5G66880.1（AtSnRK2.3）、AT4G33950（AtSnRK2.6）、AT4G40010（AtSnRK2.7）、AT1G78290（AtSnRK2.8）]，4个基因不受 ABA 激素诱导[AT5G08590（AtSnRK2.1）、AT1G10940（AtSnRK2.4）、AT5G63650（AtSnRK2.5） 、AT1G60940（AtSnRK2.10）]， 而AT2G23030（AtSnRK2.9）不受非生物胁迫诱导[19]。SnRK2基因可分为3个亚族，即GroupⅠ—Ⅲ，其中，甜瓜4 个成员属于GroupⅠ亚族，2 个成员属于Group Ⅱ亚族，3 个成员属于GroupⅢ亚族，且因为甜瓜和黄瓜同属于葫芦科，亲缘关系最近。在Group Ⅰ亚 族 中，CmSnRK2-2/4与AT5G08590.1、AT5G63650.1聚为一支，表明其可能无法被ABA 诱导 激 活。 在Group Ⅱ亚 族 中，CmSnRK2-3与AT4G40010.1（AtSnRK2.7）、AT1G78290.2（AtSnRK2.8）的亲缘关系最近，在GroupⅢ亚族中，CmSnRK2-8和AT3G50500.2（AtSnRK2.2）、AT5G66880.1（AtSnRK2.3）聚为一支，CmSnRK2-6和AT4G33950.1（AtSnRK2.6）聚 为 一 支，表 明CmSnRK2-3、CmSnRK2-6和CmSnRK2-8可能在甜瓜ABA 信号转导过程中扮演着重要角色。

图2 SnRK2基因家族系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of SnRK2 gene family

2.3 甜瓜SnRK2基因家族成员的基因结构和保守结构域分析

为研究甜瓜SnRK2 基因的外显子/内含子的结构，使用GSDS 软件对甜瓜SnRK2 的基因结构进行分析。图3a显示，甜瓜SnRK2基因的外显子数量大多为7～9 个，内含子数量为6～8 个。第Ⅰ亚家族和第Ⅲ亚家族成员之内，结构域高度保守。其中CmSnRK2-2拥有较多的外显子数目（17 个），CmSnRK2-7拥有较长的内含子结构。这一结果与大多数植物中SnRK2 基因的内含子和外显子数量基本一致[20]。

利用在线软件MEME 对甜瓜SnRK2 家族成员的保守基序进行分析，结果显示，甜瓜SnRK2 家族成员的蛋白质序列N 端激酶结构域保守性较高，包括有核苷酸结合位点和具有质子受体活性的天冬氨酸残基的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点，而SnRK2 蛋白的C 端则表现出一定的差异（图3b）。此外，第Ⅰ亚族成员内具有高度相似性的保守基序，同时对于第Ⅱ亚族成员，也具有相对较高的相似性。而第Ⅲ亚族与第Ⅰ、Ⅱ亚族之间的相似性较低，这验证了SHUKLA 等[21]对于SnRK2 基因家族的分类，SnRK2可分为SnRK2aⅠ、Ⅱ亚族和SnRK2bⅢ亚族。

图3 甜瓜SnRK2家族成员motif和基因结构分析Fig.3 Motif and gene structure analysis of SnRK2 family members in melon

2.4 甜瓜SnRK2基因家族的染色体定位

根据甜瓜的基因组序列文件和注释文件，甜瓜共含有12 条染色体。对甜瓜SnRK2 基因进行染色体定位，如图4 所示，结果表明，9 个甜瓜SnRK2 基因分布在4条染色体上，其中chr08分布基因数量最多，共有4个（CmSnRK2-1、CmSnRK2-2、CmSnRK2-3、CmSnRK2-4），chr01 分 布 成 员 最 少，仅 包 含CmSnRK2-6。此外，无明显证据证明染色体长度与包含基因数目之间呈显著相关。经共线性分析，甜瓜SnRK2基因家族成员之间无重复基因对。

图4 甜瓜SnRK2基因家族的染色体定位Fig.4 Chromosome mapping of SnRK2 gene family in melon

2.5 甜瓜SnRK2基因家族的启动子顺式作用元件分析

为了解甜瓜SnRK2 基因家族成员的转录调控模式，提取了甜瓜SnRK2 基因上游的2 000 bp 作为启动子序列进行分析，结果如图5 所示。在甜瓜SnRK2 基因的启动子序列上存在有ABA（脱落酸）、SA（水杨酸）、IAA（生长素）、GA（赤霉素）以及MeJA（茉莉酸）等多种植物激素响应元件，表明甜瓜SnRK2 基因参与了甜瓜的信号转导过程。同时，还存在多个与光合作用相关的光响应元件（ACE、GBox、Box 4、GT1-motif、G-box、GATA-motif、I-box、Gap-box），以及多种抗逆响应元件（包括无氧诱导所必需的顺式作用调节元件，参与防御和应激反应的顺式作用元件等），这也表明了甜瓜SnRK2 基因可能在甜瓜的抗逆过程中扮演着重要角色。

图5 甜瓜SnRK2基因家族启动子的顺式作用元件分析Fig.5 Cis-acting element analysis of SnRK2 gene family promoter in melon

如图5 所示，所有成员中都具有较多的光响应元件。CmSnRK2-9基因的上游顺式作用元件个数最少，CmSnRK2-5 和CmSnRK2-7中未预测到ABA响应元件，CmSnRK2-2和CmSnRK2-4具有较多的激素响应元件。

2.6 甜瓜SnRK2基因家族的组织表达模式分析

为了解甜瓜SnRK2 基因家族成员的组织表达模式，从Melonet DB 数据库[22]中获取了5 个甜瓜SnRK2 基因家族成员的组织表达信息并对其进行分析。如图6 所示，在干种子中，CmSnRK2-7和CmSnRK2-9不表达，而CmSnRK2-6和CmSnRK2-1的表达量较高；在根中，CmSnRK2-1的表达量最高，CmSnRK2-2和CmSnRK2-6的表达量次之，CmSnRK2-7的表达量最低，CmSnRK2-9不表达。CmSnRK2-1在雌花花瓣中的表达量最高，CmSnRK2-6在雌花柱头的表达量最高；CmSnRK2-9在卷须中的表达量最高。总体来说，CmSnRK2-9在甜瓜的各个组织中均表现出较低的表达水平，而CmSnRK2-1的表达量则相对较高，CmSnRK2-7在不同组织中的表达无显著差异，为组成型表达。

图6 甜瓜SnRK2基因在不同组织的表达分析Fig.6 Expression analysis of SnRK2 genes in different tissues of melon

3 结论与讨论

为了抵抗不利的环境条件，如干旱、高盐和极端温度等，植物会以牺牲生长为代价来提高胁迫耐受性并存活[23]。植物可以通过对转录因子、分子伴侣、离子通道和转运蛋白的调控来实现生理生化水平的变化[24]。越来越多的证据表明，SnRK2 蛋白激酶作为一个小型的植物特异性蛋白家族，可通过渗透胁迫被激活，成为调节ABA 信号通路的关键组成部分[25-26]，也是触发应激反应的主要驱动力。

在模式植物拟南芥逆境胁迫的研究中，SnRK2基因家族常表现出重要的抗逆功能，在水稻、玉米的抗逆过程中，SnRK2 基因家族同样具有相似的表达模式[27]。因此，在研究植物非生物逆境胁迫中，对于SnRK2 基因家族成员的鉴定和特性分析尤为重要。本研究以甜瓜的公开基因组数据为基础，对甜瓜SnRK2 基因家族成员进行了鉴定和系统分析。结果显示，甜瓜基因组中共包含有9个SnRK2基因，与黄瓜（CuSnRK2-1—11）、玉米（ZmSnRK2-1—11）、拟南芥（AtSnRK2-1—10）等物种相比，其SnRK2 基因家族成员数量基本一致，表明其基因家族成员数量与基因组大小之间无显著相关性。

在SnRK2 基因家族成员的氨基酸序列中存在2个高度保守的基序，位点1：包含核苷酸结合域I/LG/NXGXFG/AXA/V 和作为ATP 结合的赖氨酸残基;位点2：具有质子受体活性的天冬氨酸残基（活性位点）V/ICHRDLKLENTLL。但在甜瓜SnRK2 基因家族成员内序列比对结果显示，CmSnRK2-3和CmSnRK2-6只存在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的活性位点（天冬氨酸残基），无ATP 结合位点（赖氨酸残基），这表明CmSnRK2-3和CmSnRK2-6在进化过程中可能与其他家族成员之间出现了功能上的差异，同时也表明甜瓜SnRK2 基因家族成员之间可能存在着功能上的分工。

参考拟南芥中AtSnRK2基因分类，可将甜瓜SnRK2基因分为3个亚族，其中，第Ⅱ亚族和Ⅲ亚族成员受到ABA 的调控，在ABA 信号转导过程中起到了重要的调控作用。

片段复制（Segmental duplication）、串联复制（Tandem duplication）和转位事件（如反转和复制转位）是3 种主要的进化模式[28]。在这些模式中，片段和串联复制被认为是植物基因家族扩展的2个主要原因。在甜瓜的SnRK2 基因家族中，9 个家族成员分布在4条染色体上，无基因簇出现。此外，在进行基因家族共线性分析时，并未检测到基因之间的串联重复事件和片段重复事件的发生，这一现象表明，甜瓜SnRK2 基因家族成员之间可能具有相对独立的进化关系。

启动子分析结果显示，除ABA 响应元件外，在甜瓜SnRK2 基因的上游调控序列中还存在SA、MeJA、Auxin 以及GA 等多种植物激素响应元件，这一结果表明，甜瓜SnRK2基因不仅在ABA信号通路中扮演重要角色，而且可能参与了多个植物激素信号的转导过程。此外，多个逆境相关作用元件的存在也说明了甜瓜SnRK2 基因家族在甜瓜抗逆过程中的重要性。在分析上游启动子顺式作用元件时发现，CmSnRK2-7和CmSnRK2-9的顺式作用元件很少，且结合组织特异性表达热图发现，CmSnRK2-7和CmSnRK2-9的表达量也较低，说明启动子区域的特征元件在调控基因表达中发挥正相关作用。

组织表达分析结果显示，甜瓜SnRK2 基因有着多样的组织表达模式，有些基因呈组成型表达，有些基因则表现出显著的组织特异性。丰富多样的表达组织、表达模式表明不同的甜瓜SnRK2 基因之间可能存在着明确的分工，各基因之间相互合作，共同调控甜瓜的生长发育和各种生理生化过程。

综上，本试验结果表明，在甜瓜基因组中共包含有9 个SnRK2 基因，8 个预测定位于细胞核，1 个预测定位于细胞质，二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。其可分为3 个亚族，且同一亚族成员之间的motif 和基因结构较为保守，其中第Ⅰ、Ⅱ亚族具有高度保守的N 端结构域。染色体定位结果显示，9 个SnRK2 基因集中分布于4 条染色体上，无重复基因对。启动子分析结果显示，在SnRK2 基因的调控序列中有多个植物激素和逆境胁迫相关响应元件。对5 个家族成员的组织表达分析结果表明，有些SnRK2 基因在不同组织中呈组成型表达，有些基因则具有显著的组织特异性（CmSnRK2-1、CmSnRK2-6）。