菜田种养结合模式下施肥方式对土壤编码碱性磷酸酶基因微生物群落的影响*

何 宇,吕卫光, 郑宪清, 张翰林, 李双喜, 张娟琴, 张海韵，白娜玲**

菜田种养结合模式下施肥方式对土壤编码碱性磷酸酶基因微生物群落的影响*

何 宇1,2,吕卫光1,3,4,5, 郑宪清1,3,4,5, 张翰林1,3,4, 李双喜1,3,4,5, 张娟琴1,3, 张海韵1,4，白娜玲1,3,4,5**

（1.上海市农业科学院生态环境保护研究所，上海 201403；2.上海海洋大学海洋生态与环境学院，上海 201306；3.农业农村部上海农业环境与耕地保育科学观测试验站，上海 201403；4.上海市农业环境保护监测站，上海 201403；5.上海市设施园艺技术重点实验室，上海 201403）

为明确菜田种养结合模式下施肥方式对土壤编码碱性磷酸酶基因的微生物群落结构和多样性的影响机制，通过Illumina MiSeq高通量测序手段，系统分析了4种不同施肥方式，即不施肥（CK）、施常规化肥（CF）、施有机肥（OF）、有机无机肥混施（MF）对花菜收获时0−20cm土层土壤理化性质、碱性磷酸酶（ALP）、微生物量磷（MBP）以及微生物群落的影响。结果表明：（1）与CK相比，OF处理可显著提高土壤有机质、总氮、速效磷和Ca含量47.83%、38.46%、104.81%和69.21%（P<0.05）；OF和MF处理均显著提高ALP活性；CF和OF分别显著增加MBP含量56.12%和195.16%，OF处理中MBP含量最高（105.40mg·kg−1）；（2）菜田种养结合模式不同施肥处理中假单胞菌属（）为优势属，CF和MF较CK显著降低了假单胞菌属相对丰度33.39%和45.52%；施肥降低土壤微生物Chao1指数，MF提高其多样性（Simpson）和均匀度（Simpsoneven）；（3）影响微生物群落结构的关键环境因子为MBP、AP、ALP；微生物α多样性指数与土壤性状指标无显著相关性。因此，菜田种养结合模式下，不同施肥处理改变了土壤理化和生物性质，从而驱动了土壤微生物群落组成、结构和多样性变化。

菜田种养结合；施肥方式；碱性磷酸酶；基因；高通量测序

传统农业单一种植与养殖分离的生产方式，导致原本互补的种植业、养殖业成为面源污染的首要来源，且降低了农业综合经济效益[1]。大量研究表明，立体生态种养能够发挥生物群体组合的共同功能，实现物种层次、能量循环、物质转化和技术等要素的优化，是提高农业收入和改善生态环境的有效途径，如稻-渔种养、稻-鸭种养、渔-菜共生等模式[2−4]。例如，将曝气生物滤池与蔬菜栽培相结合的密闭循环水产养殖系统，蔬菜和罗非鱼均生长良好，且保证了95%以上水资源持续再生[5]。结合生物浮床技术的水培蔬菜和水产动物共生为经典的蔬菜种养结合模式，但该模式限制了蔬菜种植种类和生长需求；而水旱共作的菜田种养模式防旱防涝，扩大了作物和水产动物选择范围，还有利于改善系统内产地环境[6]，同时，仿野生养殖的水产动物产品质量好、多订单贸易[2,7]。

磷是植物必需的常量养分之一，更是农田生态系统中至关重要的营养元素，但中国农业生产中磷当季利用率仅为5%～25%[8]。土壤有机磷占磷素总量的30%～80%，但不能直接被植物利用，需先在磷酸酶作用下转化为无机磷才可用于植物生长代谢。碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, ALP）是土壤有机磷水解为可供植物利用的无机磷的关键酶，其基因家族主要包括、、等。在陆地生态系统中出现频率最高，可作为关键生物指示物用于研究土壤有机磷的转化[9]。低磷条件下，诱导基因上调，增加磷酸盐吸收及转运的酶，共同构成磷胁迫调节子，从而加速土壤有机磷的转化过程；而在磷充足的条件下，基因表达受到抑制，ALP活性降低，有利于有机磷的稳定积累[10]。Luo等[9]发现，长期有机无机肥混施和无机肥单施分别显著增加和降低了土壤中微生物丰度。长期施化肥处理中速效磷（Available phosphorous, AP）含量提高，磷素充足，使得细菌群落丰度和多样性指数均显著降低[11]。但王静等[12]指出，有机肥和有机无机配施处理中的土壤细菌、真菌、功能微生物的丰度和ALP活性都显著高于不施肥对照和无机肥处理。环境因子如气候、水分、土壤类型、pH、土地利用方式、农艺措施和养分浓度均可影响ALP活性和微生物的丰度、多样性和群落结构[13]。

由于环境因子的变化，施肥方式对土壤微生物的影响尚不明确，目前关于草原或常规农田的研究较多，但对水旱共作菜田种养结合系统的研究还鲜有报道。因此，本研究依托上海市农业科学院菜田种养结合（花菜-芋艿轮作）定位试验站，以花菜季为研究对象，探究不同施肥方式（不施肥、施常规化肥、施有机肥和有机无机混施）对土壤理化性质、ALP及微生物等指标的影响，用于评价不同施肥方式的培肥与增产效果，揭示磷转化过程中的重要功能菌类群，以期为菜田种养结合模式构建科学合理的施肥制度提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验在上海市农业科学院庄行综合试验站（30°53'N, 121°23'E）菜田种养结合试验小区开展，站内年平均气温为15.8℃，年平均降水量为1178.0mm。土质为黏壤土，作物种植模式为花菜（品种为“台松”）-芋艿（品种为“崇明香酥芋”）轮作，已种植3a。试验地区土壤2015年初始理化指标为，pH7.48，有机质（SOM）20.08g·kg−1，总氮（TN）1.85g·kg−1，总磷（TP）2.64g·kg−1，速效氮（AN）77.44mg·kg−1，速效磷（AP）35.90mg·kg−1。

1.2 试验设计

花菜种植和收获时间分别为2018年9月28日和2019年4月2日。试验设置4处理，即不施肥（CK）；施常规化肥（CF）；施有机肥（OF）；有机无机混施（MF）。小区为完全随机区组设计，每个处理3个重复。单个小区包括环形沟和种植区，种植区面积24.00m2，水域面积13.44m2（图1）。投放水生动物种类为黄鳝+泥鳅+鲫鱼，其投放量为黄鳝75kg·hm−2，泥鳅15万尾·hm−2，鲫鱼75kg·hm−2。水产动物以诱集灯捕获飞虫及水中营养为食物，不额外投加饵料。作物收获后将地上部秸秆及根茬移除，水产动物也一并捕捞收集，农田管理措施与当地高产田一致。

施肥处理为等氮磷钾处理，施用的N、P（P2O5）和K（K2O）肥分别约为402、118和285kg·hm−2。施肥主要分为基肥、莲座肥、花球初期肥、花球中期肥等。OF中有机肥全部用作基肥，折算为每个小区施用有机肥48.22kg。MF处理中施入约25%有机肥作为基肥，其余部分用无机肥补足。具体肥料用量见表1。

1.3 项目观测

1.3.1 土壤生物性质和理化性质的观测

花菜收获后，各小区种植区选取若干分布均匀且具代表性的采样点，依据“S”形五点采样法用直径4cm不锈钢采土器采集0-20cm土壤样品，并去除土壤表层枯叶、石子及根系。将同小区样品均匀混合后装入聚乙烯封口袋中，做好标记。土样经过自然风干后研磨过0.25mm土壤筛，用于测定土壤酶活性。ALP活性采用磷酸苯二钠比色法测定，加入硼酸盐缓冲液，37℃下培养，以每克土每24h酶促反应产生的酚的mg数表示。微生物量磷（MBP）指土壤中所有活体微生物中所含有的磷，主要成分是核酸、磷脂等易矿化有机磷及部分无机磷，是有效养分的储备库，测定方法参考文献[14]中的灭菌-NaHCO3法。土壤SOM测定采用重铬酸钾氧化-外加热法，土壤pH采用电位法（水:土=2.5:1）测定，TN含量采用凯氏定氮法-自动定氮仪测定，TP（以P2O5计）采用酸溶-钼锑抗比色法测定，AP采用0.5M NaHCO3浸提-钼锑抗比色法测定[15]。

图1 菜田种养结合模式小区示意图

表1 试验处理及肥料用量（kg·hm−2）

注：有机肥2-0.6-1.5；复合肥15-15-15；尿素中含氮量46%；过磷酸钙中含磷量16%；硫酸钾中含钾量50%。CK：不施肥；CF：施常规化肥；OF：施有机肥；MF：有机无机混施。下同。

Note: Organic fertilizer: 2-0.6-1.5; compound fertilizer: 15-15-15; urea contains 46% nitrogen; superphosphate (SP) contains 16% phosphorus; potassium sulfate (PS) contains 50% potassium. In the treatments, CK: no fertilization; CF: conventional chemical fertilizer; OF: organic fertilizer; MF: organic-inorganic mixed fertilizer. The same as below.

1.3.2 土壤样品DNA提取及高通量测序

将花菜收获季所取土样除去杂质，分成两部分，一部分用于测定土壤酶活性和理化性质，另一部分存于-80℃用于土壤DNA提取。按照MiBio PowerSoil®DNA Isolation Kit试剂盒手册的操作步骤提取土壤微生物总DNA，并使用超微量分光度计检测总DNA浓度和质量。利用引物序列ALPS-F730（5'-CAGTGGGACGACCACGAGGT-3'）和ALPS-1101（5'-GAGGCCGATCGGCATGTCG-3'）扩增基因，片段长度约371bp。PCR扩增反应体系为PCR Mix 12.5μL，上下游引物（10mM）各1μL，DNA模板1μL，H2O补足至25μL。反应参数为94℃预变性3min，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min。高通量测序送由上海某公司采用Illumina MiSeq平台完成。

数据分析主要包括原始数据处理、操作分类单元（OTU）筛分与归类、α多样性、环境因子关联分析等。经质控及数据处理后得到可用于后续分析的高质量序列（Clean Data），按照相似度97%以上进行OTU聚类，以丰度最大的序列为代表序列。比对数据库为美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）本地核酸序列数据库（Nucleotide Sequence Database，NT）。

1.4 数据处理

数据的整理与统计分析用Excel 2020和SPSS 16.0的one-way ANOVA法，采用ORIGIN 2019和R语言绘制柱形图、扇形图、韦恩图（Venn）、基于距离的冗余分析（distance-based Redundancy Analysis，db-RDA）等。

2 结果与分析

2.1 种养结合模式下施肥方式对土壤微生态环境的影响

由表2可见，不同施肥方式对菜田种养结合模式的土壤理化性质有一定影响。菜田种养结合模式下，各处理花菜土壤均呈弱碱性，pH在7.96～8.69，处理间差异不显著，说明土壤酸碱性未受到施肥方式的影响。施肥方式对土壤总磷（TP）含量也无显著影响。施肥方式对土壤中SOM含量有一定影响，其中有机肥（OF）处理中SOM含量最高（2.72%），显著高于其它处理（P<0.05），其它三个处理间差异不显著。从数值看，有机无机混施（MF）处理中SOM含量次高（2.09%），常规化肥（CF）处理有机质含量最低（1.62%），说明有机肥施入会使SOM含量提高，而化肥则降低SOM含量。土壤TN含量与SOM类似，在OF和MF处理中含量较高，相较于CK增幅为30.77%～38.46%，在CK和CF处理中含量较低。有机肥的施加提高了土壤速效磷（AP）和钙（Ca）含量，OF处理最显著（P<0.05），与对照CK相比分别提高了104.81%和69.21%；MF处理次之，增幅为51.53%和36.64%。

不同施肥方式对菜田种养结合模式土壤生物性质的影响不同（图2）。菜田种养结合模式下，OF和MF处理均显著提高了土壤ALP酶活（P<0.05），分别为14.60μg·min−1·g−1和12.06μg·min−1·g−1，二者无显著差异，可见有机肥施用有利于提高土壤碱性磷酸酶活性。土壤微生物量是土壤有机磷最为活跃的部分，是植物磷素营养非常重要的来源。施肥方式同样显著影响了土壤微生物量磷（MBP），与CK相比，常规施肥（CF）和有机肥（OF）处理显著提高了MBP含量（P<0.05），且OF处理中MBP含量最高（105.40mg·kg−1）；但MF处理中MBP含量与CK处理无显著差异。

表2 花菜收获时不同施肥处理的土壤理化性质比较

注：SOM：土壤有机质；TN：总氮；TP：总磷；AP：速效磷；Ca：钙。表中数据为平均值±标准误，小写字母表示处理间在0.05水平上的差异显著性。下同。

Note: SOM: soil organic matter; TN: total nitrogen; TP: total phosphorus; AP: available phosphorus; Ca: calcium. The bar is the mean data ± SD; lowercase indicates significant difference among treatments at 0.05 level. The same as below.

图2 菜田种养结合模式不同施肥处理下土壤碱性磷酸酶和微生物量磷比较

2.2 菜田种养结合模式下施肥方式对土壤phoD微生物群落组成及多样性的影响

2.2.1微生物群落物种组成分析

由图3a和表3可知，种养结合模式下不同施肥处理改变了微生物群落结构，但未显著影响其群落组成。对相对丰度超过1%的门水平物种分析发现，土壤中优势菌门包括变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes），占总细菌群落数的97.56%以上。其中变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度为67.90%～85.56%，放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度为9.35%～28.61%，芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）的丰度范围为1.89%～5.45%。此外，酸杆菌门（Acidobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、浮霉菌门（Planctomycetes）和蓝细菌门（Cyanobacteria）的相对丰度也较高。相比于CK，OF处理显著提高了变形菌门（Proteobacteria）相对丰度，增幅为13.13%，而CF和MF与对照无显著差异。CF相较于CK显著提高了放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度，增幅为64.61%。CF和MF较CK处理显著降低了芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）相对丰度96.51%和59.27%。对于浮霉菌门（Planctomycetes）而言，CF与OF处理间表现出显著差异（P<0.05）。不同处理间的酸杆菌门（Acidobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和蓝细菌门（Cyanobacteria）相对丰度差异并不显著。

图3 花菜收获时不同施肥处理下phoD微生物门（a）、属（b）水平群落相对丰度

表3 花菜收获时不同施肥处理土壤phoD微生物门水平相对丰度（%）比较

由图3b和表4可知，菜田种养结合模式不同施肥处理下属水平相对丰度前10的微生物依次为假单胞菌（）、贪铜菌属（）、链霉菌属（）、慢生根瘤菌属（）、多形单胞菌属（）、溶杆菌属（）、芽单胞菌属（）、山岗单胞菌属（）、游动放线菌属（）和变异杆菌属（）。上述菌属主要分布在变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）。假单胞菌属（）为优势属，丰度范围为20.30%～37.26%。在菜田种养结合模式下，不同施肥方式显著影响了假单胞菌属（）、链霉菌属（）、多形单胞菌属（）、芽单胞菌属（）、山岗单胞菌属（）的相对丰度（P<0.05）。与CK相比，CF和MF处理显著降低了假单胞菌属（）的相对丰度，降幅为33.39%和45.52%，芽单胞菌属（）相对丰度降幅为64.14%和59.27%。对于有机肥施用而言，OF和MF显著提高了多形单胞菌属（）的相对丰度132.08%和83.02%；并显著降低了山岗单胞菌属（）的相对丰度，范围为14.97%～70.05%。其他属水平微生物各处理间差异不显著。

表4 花菜收获时不同施肥处理下土壤phoD相对丰度（%）前10属水平物种比较

2.2.2 对微生物群落α多样性的影响分析

Venn图分析表明（图4a），4个处理中共有的OTUs数目为617个，占总OTUs数目的8.14%。CK、CF、OF、MF处理中独有的OTUs数分别为1748、1156、791和935，分别占总OTUs数目的23.06%、15.25%、10.43%和12.33%。CK、CF、OF、MF处理中所包含的总OTUs数分别为4068、2960、2717和2762。各处理所包含的OTUs数及独有OTUs数均以CK最多，OF和MF最少。表明施肥减少了土壤微生物类群。共有的OTUs中，有15个OTUs数超过1%，主要分布在变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）（图4b）。

表5表明，菜田种养结合模式下，施肥方式显著影响了土壤微生物丰富度（Chao1）、多样性（Simpson）和均匀度（Simpsoneven）（P<0.05）。不管是施加无机肥还是有机肥均显著降低了微生物的Chao1值，范围为33.40%～35.80%。Simpson指数值越大，群落多样性越低，MF处理中土壤样本多样性高于OF处理（P<0.05），但与CK相比，均无明显差异。Simpsoneven指数为均匀度指标，施肥处理（CF、OF、MF）提高了土壤微生物均匀度，其中MF处理最高，为0.05。而对于Shannon值，各处理间无显著差异。因此，在菜田种养结合模式下，肥料施用降低土壤微生物丰富度，且MF能够增加微生物的多样性和均匀度。

图4 菜田种养结合模式下不同施肥处理土壤中phoD微生物Venn图(a)及共有OTUs分析(b)

表5 花菜收获时不同施肥处理对土壤phoD微生物α多样性的影响

2.3 菜田种养结合模式下土壤phoD微生物群落结构与环境因子关联性分析

为避免较强多重共线性环境因子的影响，通过方差膨胀因子（variance inflation factor，VIF）分析，筛选去除VIF值>10的无用环境因子，筛选后的7个环境因子指标用于进行基于unweighted-unifrac距离的冗余分析（db-RDA）。由图5可见，不同施肥处理对土壤微生物群落结构有显著影响，各环境因子均与CAP1轴正相关。CAP1和CAP2轴分别解释了微生物群落组成变化的12.35%和9.91%，其中CAP1较好地将施加化肥处理（施常规化肥CF和有机无机混施MF）与未施加化肥处理（对照CK和施有机肥OF）区分开来，但有无有机肥施加处理间的区分度不明显。从整体看来，环境因子对CF和MF处理影响更大。同时，影响微生物群落结构的关键环境因子为微生物量磷（MBP）（P=0.006）和速效磷（AP）（P=0.028），而碱性磷酸酶（ALP）次之，其P值为0.091。如表6所示，相关性分析表明，菜田种养结合条件下，花菜收获季土壤中ALP活性与除pH外的土壤理化性状（SOM、TN、TP、AP和Ca）和MBP呈显著正相关；但微生物α多样性指数与土壤性状无显著相关性。Ca作为基因合成的ALP酶活性的辅酶因子，可间接影响群落组成[9]，Ca与磷相关指标（TP、AP、MBP、ALP）呈显著正相关，但与微生物α多样性指数无明显相关关系。

图5 菜田种养结合模式下不同施肥处理phoD微生物群落结构与环境因子的db-RDA关联分析

表6 土壤性状与phoD微生物群落α多样性的Pearson相关分析

注：*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）。MBP：微生物量磷，ALP：碱性磷酸酶。

Note:*is P<0.05;**is P<0.01. MBP: microbial biomass phosphorus; ALP: alkaline phosphatase.

3 结论与讨论

3.1 讨论

3.1.1 菜田种养结合模式下不同施肥处理对土壤理化和生物性状的影响

本试验结果表明，菜田种养结合模式下，施有机肥处理（OF）显著增加了土壤有机质（SOM）、总氮（TN）、速效磷（AP）和钙（Ca）含量（P<0.05），有机无机混施（MF）中养分含量增幅次之，这与前人研究结果一致[12]。施常规化肥处理（CF）则降低了土壤SOM含量，蒋太明等[16]在黄壤土中也发现了同样趋势。邬奇峰等[17]以杭嘉湖平原典型稻麦轮作区长期定位施肥试验土壤为对象，发现所有施肥处理均降低土壤pH、提高SOM和TN/TP/TK含量，且秸秆与化肥配施、有机肥、有机无机混施等处理效果更显著。该结果的不同可能是由于作物种类、土壤质地、土地利用方式等原因的影响。本次试验也同样观察到，OF处理组养分释放慢，导致花菜产量低，MF的花菜产量是OF的4.56倍。化学肥料可及时为作物提供所需速效养分；有机肥不仅为土壤微生物提供碳源，还间接提高养分累积的供应能力；有机无机配施则在避免单施有机肥养分释放慢、速效养分含量不足的同时，也避免了化肥引起的土壤有机质水平偏低的问题[18]。

土壤酶活性受施肥等因素影响较大，磷酸酶活性高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性[19]。本试验中，CF处理中速效养分无机磷的释放抑制了ALP活性（8.46μg·min−1·g−1），而有机磷肥料的施用（OF和MF处理）则促进了ALP活性（12.06～14.60μg·min−1·g−1），可见有机肥添加有利于提高土壤酶活性，从而有利于养分循环与周转，与前人报道一致[11,20]。有机肥施用主要增加土壤有机磷，有机磷需在微生物参与下逐步矿化为植物可直接利用的磷[21]，因此，ALP活性在OF和MF处理中显著提高。花菜收获时，OF处理中土壤MBP值最高，可能原因在于有机肥养分释放缓慢，此时磷素充足，含磷微生物可在生物量中储存磷素[22]。在土壤可利用磷含量较低时，微生物为了获得更多磷素，加速其编码蛋白的功能[23−25]，即碱性磷酸酶（ALP）活性增加。但在本研究中，ALP活性与土壤性状（SOM、TN、TP、AP、MBP和Ca）呈显著正相关，且MBP含量与SOM、AP、ALP和Ca呈显著正相关。已有研究报道ALP与土壤pH、TN、SOM等指标呈正相关，与总磷（TP）和生物可利用的速效磷（AP）呈负相关[9]，本试验中结果不一致的主要原因可能是与菜田种养结合模式的水旱微环境、土壤微生物群落的数量及活性有关[6,14]。因此，后续研究应注重花菜不同生长时期的节点分析，进一步阐明土壤中ALP和MBP的动态变化规律。

3.1.2 菜田种养结合模式下不同施肥处理对土壤微生物群落及多样性的影响

微生物群落对磷肥投入的反应在不同环境地点和试验条件下有所不同。本试验表明，变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）是优势菌门，所占丰度为93.01%～96.85%，这与前人的研究结果一致[26]，但廖梓鹏[13]对珠三角农田土壤微生物分析发现，优势门为未培养细菌（uncultured_Bacteria），其次为变形菌门（Proteobacteria），这可能与土壤类型及种植模式不同有关。假单胞菌（）为不同施肥处理的优势属，相对丰度最高（20.30%～37.26%）。而在常规草地或耕地中的优势微生物主要为鞘氨醇单胞菌（）、芽孢杆菌（）、甲基杆菌（）和慢生根瘤菌（）等[21,27]，可见菜田种养结合模式下的微生物群落组成有别于其他农田或种植模式。丰度前10物种中有显著差异的属为假单胞菌（）、链霉菌（）、多形单胞菌（）、芽单胞菌（）和山岗单胞菌（）。假单胞菌（）在对照处理（CK）中含量最高，可能在贫磷条件下的有机磷矿化中发挥重要作用[11]。链霉菌（）为环境中常见的生防益生菌，能够产生次生代谢产物，促进植物生长[28]；其在本试验中的丰度变化推测可能与花菜的长势情况有关。多形单胞菌（）为固氮菌，在OF和MF处理中丰度的增加，推测该种微生物可能将磷矿化与氮固定相耦合[29]。而与氮素循环相关的芽单胞菌（）和以真菌菌丝体为食的山岗单胞菌（）的相对丰度均由于肥料施用呈现一定程度的降低，具体原因尚不明确[30]。此外，丰度较低且与氮、磷元素循环相关的慢生根瘤菌、中华根瘤菌、黄杆菌和节杆菌[9,31−32]，也受到了施肥的影响。因此，考虑到种养结合模式能够显著提高肥料养分利用效率[7]，该系统下的固氮、解磷相关功能菌在土壤氮循环和磷周转间的耦合关系需加强研究。

本试验结果表明，在菜田种养结合模式下，肥料施用降低了土壤微生物丰富度（Chao1），但MF增加了微生物的多样性（Simpson）和均匀度（Simpsoneven），说明有机无机混施有利于重塑微生物结构。基于unweighted-unifrac距离的冗余分析（db-RDA）表明，微生物群落结构与pH、AP、ALP、Ca、TN、TP、MBP存在相关性，表明这些土壤理化和生物性质在编码碱性磷酸酶基因的微生物群落变化中发挥重要作用。其中MBP、AP、ALP的作用要强于其他土壤指标，它们都是影响含土壤编码碱性磷酸酶基因的细菌群落结构的主要因素[11]，涉及有机磷与无机磷之间转运、矿化和同化等过程。磷细菌对磷肥的不同反应表现可能是由于磷肥的不同形式、土壤类型和试验条件造成的[33]。Pearson相关分析表明，微生物的α多样性与任何环境因素均无显著相关性，说明其对施肥方式的变化响应不敏感，与Liu等的研究结果一致[33]。综上所述，菜田种养结合模式下，不同施肥处理改变了土壤理化和生物性质，从而驱动了土壤微生物群落组成、结构和多样性变化，有助于为种养结合模式合理施肥提供科学依据。

3.2 结论

（1）菜田种养结合模式下，不同施肥处理影响了土壤理化性质。其中施有机肥处理（OF）显著提高了土壤有机质（SOM）、总氮（TN）、土壤速效磷（AP）和钙（Ca）含量，增幅分别为47.83%、38.46%、104.81%和69.21%（P<0.05）。有机无机混施处理（MF）则分别提高了SOM、TN、AP和Ca含量13.59%、30.77%、51.53%和36.64%。与对照处理（CK）相比，OF和MF均显著提高了土壤碱性磷酸酶（ALP）活性67.05%和37.99%（P<0.05），二者无显著差异。土壤微生物量磷（MBP）表现为CF和OF较CK分别显著增加了56.12%和195.16%，且OF处理中MBP含量最高（105.40mg·kg−1）。

（2）菜田种养结合模式下，土壤微生物优势菌门包括变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes），占总群落数的97.56%以上。相比于CK，OF处理显著提高了变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度13.13%；CF显著提高了放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度64.61%；CF和MF显著降低了芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）相对丰度96.51%和59.27%。假单胞菌属（）为优势属，CF和MF处理较CK显著降低了假单胞菌属的相对丰度33.39%和45.52%。肥料施用降低土壤微生物丰富度（Chao1），MF增加了微生物的多样性（Simpson）和均匀度（Simpsoneven）。

（3）菜田种养结合模式下，施肥方式影响微生物群落结构，影响微生物群落结构的关键环境因子为MBP、AP、ALP。微生物α多样性指数与土壤性状无显著相关性；ALP与土壤SOM、TN、TP、AP、MBP和Ca等含量显著正相关。

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Effects of Fertilization Regimes on Soil Alkaline Phosphatase Gene Encoding Microbial Community under the Integrated Planting and Breeding System in the Vegetable Field

HE Yu1,2, LV Wei-guang1,3,4,5, ZHENG Xian-qing1,3,4,5, ZHANG Han-lin1,3,4, LI Shuang-xi1,3,4,5,ZHANG Juan-qin1,3, ZHANG Hai-yun1,4, BAI Na-ling1,3,4,5

(1. Eco-environmental Protection Research Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403; 2. Faculty of Marine Ecology and Environment, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Shanghai Agri-environmental and Cultivated Land Conservation of Scientific Observation and Experiment Station, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shanghai 201403; 4. Shanghai Agri-environmental Protection Monitoring station, Shanghai 201403; 5. Shanghai Key Laboratory of Protected Horticulture Technology, Shanghai 201403)

A field experiment was systematically conducted, using Illumina MiSeq high-throughput sequencing, to analyze the impact of four different fertilizer application regimes (CK, no fertilization; CF, conventional chemical fertilizer; OF, organic fertilizer; MF, organic-inorganic mixed fertilizer) on the soil physicochemical properties, alkaline phosphatase (ALP), microbial biomass phosphorus (MBP), and(gene encoding alkaline phosphatase) microbial community in 0-20cm soil layer at cauliflower harvest season, thus identifying the underlying mechanism of effects of different fertilization regimes on the structure and diversity ofmicrobe under integrated planting and breeding system in vegetable field. The results showed that: (1) compared to CK, OF significantly increased the contents of soil organic matter, total nitrogen, available phosphorus and Ca by 47.83%, 38.46%, 104.81% and 69.21%, respectively (P<0.05); both OF and MF significantly increased ALP activity. The MBP content in CF and OF was improved by 56.12% and 195.16%, respectively, compared with CK; the MBP content in OF was the highest (105.40mg·kg−1). (2)was the dominant genus under different fertilization treatments. CF and MF significantly reduced the relative abundance ofby 33.39% and 45.52%, respectively, compared with CK. Fertilization decreased the Chao1 index, and MF increased both the diversity (Simpson index) and evenness (Simpsoneven index) of soilmicroorganisms. (3) MBP, AP, and ALP were the key environmental factors affecting themicrobial community structure. There was no significant correlation betweenmicrobial α diversity indexes and soil properties. Therefore, under the integrated planting and breeding system in vegetable field, different fertilization treatments changed soil physicochemical and biological properties, and thus drove the changes of composition, structure and diversity of soilmicrobial community.

Integrated planting and breeding system in the vegetable field; Fertilization regimes; Alkaline phosphatase;gene; High-throughput sequencing

10.3969/j.issn.1000-6362.2022.07.003

何宇,吕卫光,郑宪清,等.菜田种养结合模式下施肥方式对土壤编码碱性磷酸酶基因微生物群落的影响[J].中国农业气象,2022,43(7):538-550

2021−09−18

上海市科技兴农推广项目[沪农科推字（2021）第2-2号]；国家农业环境奉贤观测实验站项目（NAES035AE03）；上海市农业科学院卓越团队建设计划项目[农科创卓2022(008)]

白娜玲，副研究员，博士，主要从事微生物生态研究，E-mail：bainaling@saas.sh.cn

何宇，E-mail：646747331@qq.com