重症肺炎患者外周血NLRP3炎性小体表达水平的变化及临床意义

刘艳辉 范永会 王建文

重症肺炎是常见的呼吸系统危重症，由普通肺炎进展而来，病情重、救治难度大、死亡率高。在重症肺炎的病情进展过程中，炎症反应的过度激活是重要的病理生理特征，炎症反应不仅直接导致肺内病变的进展，还会引起全身炎症反应、导致全身多个脏器损害，进而加重病情、增加死亡率［1⁃2］。目前，关于重症肺炎发病过程中炎症反应的调控机制尚不完全清楚，深入研究相关的分子机制有助于发现新的临床诊疗靶点、具有现实的临床意义。NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（Nod⁃like Receptor，Pyrin Domain Containing 3，NLRP3）炎症小体是调控炎症反应的重要分子，由模式识别受体NLRP3 及凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosis⁃asociated Speck⁃like Pro⁃tein Containing a CARD，ASC）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶⁃1（cysteinyl aspartate specific pro⁃teinase⁃1，Caspase⁃1）组成。NLRP3 炎症小体识别病原菌后发生活化，进而通过Caspase⁃1 的生物学功能使白介素（interleukin，IL）⁃1β、IL⁃18 的前体裂解为具有促炎活性的成熟体，进而介导炎症反应的级联放大激活［3］。本研究将以NLRP3 炎症小体为切入点进行重症肺炎的分析，具体研究重症肺炎患者外周血NLRP3 炎性小体表达水平的变化及临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2018年1月至2021年12月期间平煤神马医疗集团总医院收治的72 例重症肺炎患者和86 例普通肺炎患者，分别作为重症肺炎组和普通肺炎组，纳入标准：①符合《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2016年版）》［4］中重症肺炎或普通肺炎的诊断标准；②留取外周血及血清样本；③临床资料完整；④所有患者家属均知情并签署同意书。排除标准：①有肺结核、支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等呼吸系统疾病病史；②合并恶性肿瘤、自身免疫性疾病或正在使用免疫制剂、激素的患者；③入院前接受过抗感染治疗。另取同期进行健康体检且取得知情同意的105 名健康志愿者作为对照组。重症肺炎组中男性42 例、女性30 例，年龄平均（49.51±9.77）岁；普通肺炎组中男性55 例、女性31 例，年龄平均（48.81±9.55）岁；对照组中男性57 例、女性48 例，年龄平均（46.11±8.25）岁。三组间一般资料的比较差异无统计学意义（P＞0.05）。研究获得医院伦理委员会批准。

1.2 外周血NLRP3、ASC、Caspase⁃1 mRNA 表达水平的检测

入院后取重症肺炎组和普通肺炎组患者的外周静脉血3～5 mL，体检时取对照组志愿者的外周静脉血3～5 mL，EDTA 抗凝后采用全血RNA 提取试剂盒（北京天根生化公司）提取外周静脉血中的RNA，采用cDNA 第一链合成试剂盒（北京天根生化公司）将外周血中提取得到的RNA 反转录为cDNA，采用荧光定量检测试剂盒（北京天根生化公司）对cDNA 中的NLRP3、ASC、Caspase⁃1进行荧光定量PCR 检测，按照试剂盒说明书配置PCR反应体系，在荧光定量PCR 仪对NLRP3、ASC、Caspase⁃1、β⁃actin 进行PCR 扩增，得到反应的循环曲线及阈值（Ct），以β⁃actin 为内参，按照公式2⁃ΔΔCt计算NLRP3、ASC、Caspase⁃1 的mRNA 表达水平。

1.3 血清IL⁃1β、IL⁃18 含量的检测

入院后取重症肺炎组和普通肺炎组患者的外周静脉血3～5 mL，体检时取对照组志愿者的外周静脉血3～5 mL，静置凝血后速度3 000 r/min、半径5 cm离心10 min，分离血清，采用酶联免疫吸附法试剂盒（上海酶联生物科技公司）检测IL⁃1β、IL⁃18 的含量。

1.4 实验室指标的检测

入院后采用血常规仪（南京贝登医疗，型号：BC30S）检测白细胞计数（WBC）、超敏C 反应蛋白（hs⁃CRP），采用生化仪检测降钙素原（PCT），采用血气分析仪（美国爱德士，型号：OPTI CCA⁃TS）检测pH 值、动脉血氧分压（PaO2）、动脉血二氧化碳分压（PaCO2）。

1.5 预后的评估

根据入院后28 d 的生存情况评估预后。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件进行数据统计分析，计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验；28 d 累积生存采用K⁃M 曲线表示，采用log rank 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组外周血NLRP3、ASC、Caspase⁃1 mRNA表达水平的比较

三组外周血NLRP3、ASC、Caspase⁃1的mRNA表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。NLRP3、ASC、Caspase⁃1mRNA 表达水平的多组间比较：重症肺炎组＞普通肺炎组＞对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组间外周血NLRP3、ASC、Caspase⁃1 mRNA 表达水平的比较（xˉ±s）Table1 Comparison of NLRP3，ASC and caspase⁃1 mRNA expression levels in peripheral blood among groups

2.2 外周血NLRP3、ASC、Caspase⁃1 对普通肺炎和重症肺炎的鉴别价值

外周血NLRP3、ASC、Caspase⁃1 表达水平指标均能鉴别普通肺炎和重症肺炎。见表2、图1。

表2 外周血NLRP3、ASC、Caspase⁃1 平鉴别普通肺炎和重症肺炎的ROC 曲线分析Table 2 ROC curve analysis of NLRP3，ASC and caspase⁃1 levels in peripheral blood in differentiating common pneumonia from severe pneumonia

图1 外周血NLRP3、ASC、Caspase⁃1 平鉴别普通肺炎和重症肺炎的ROC 曲线Figure 1 ROC curve of NLRP3，ASC and caspase⁃1 levels in peripheral blood in differentiating common pneumonia from severe pneumonia

2.3 各组血清IL⁃1β、IL⁃18 含量的比较

三组血清IL⁃1β、IL⁃18 的含量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；血清IL⁃1β、IL⁃18 含量的多组间比较：重症肺炎组＞普通肺炎组＞对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 三组间血清IL⁃1β、IL⁃18 含量的比较（±s）Table 3 Comparison of serum IL⁃1β，IL⁃18 contents among groups（±s）

表3 三组间血清IL⁃1β、IL⁃18 含量的比较（±s）Table 3 Comparison of serum IL⁃1β，IL⁃18 contents among groups（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与普通肺炎组比较，bP＜0.05。

组别重症肺炎组普通肺炎组对照组n 72 86 105 IL⁃1β（ng/mL）7.61±1.15ab 4.71±0.84a 2.49±0.72 IL⁃18（ng/mL）9.59±1.03ab 7.79±1.25a 4.14±0.83

2.4 重症肺炎组患者外周血NLRP3、ASC、Cas⁃pase⁃1 与血清IL⁃1β、IL⁃18 的相关性

经Pearson 检验，重症肺炎组患者外周血NLRP3、ASC、Caspase⁃1的mRNA 表达水平与血清IL⁃1β、IL⁃18 的含量呈正相关（P＜0.05）。见表4。

表4 重症肺炎组患者外周血NLRP3、ASC、Caspase⁃1与血清IL⁃1β、IL⁃18 的相关性Table 4 The correlation between NLRP3，ASC，caspase⁃1 in peripheral blood and serum IL⁃1β，IL⁃18 in patients with severe pneumonia

2.5 重症肺炎组中不同NLRP3 表达水平的患者实验室指标的比较

根据重症肺炎组患者外周血NLRP3mRNA 表达水平的中位数将其分为低表达患者（表达水平＜中位数）、高表达患者（表达水平≥中位数）。NLRP3 高表达患者的WBC、hs⁃CRP、PCT、PaCO2水平高于NLRP3 低表达患者，PaO2水平低于NLRP3低表达患者（P＜0.05），pH 值与NLRP3 低表达患者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表5 重症肺炎组中NLRP3 高表达和低表达患者实验室指标的比较（±s）Table 5 Comparison of laboratory indexes between patients with high and low expression of NLRP3 in severe pneumonia group（±s）

表5 重症肺炎组中NLRP3 高表达和低表达患者实验室指标的比较（±s）Table 5 Comparison of laboratory indexes between patients with high and low expression of NLRP3 in severe pneumonia group（±s）

NLRP3高表达低表达t 值P 值n 36 36 WBC（×109/L）19.79±2.25 14.85±1.84 10.198＜0.001 hs⁃CRP（mg/L）54.19±9.69 40.38±7.78 5.206＜0.001 PCT（ng/mL）9.39±1.32 7.42±1.29 5.851＜0.001 PaO2（mmol/L）81.31±11.32 87.74±12.57 2.269 0.026 PaCO2（mmol/L）50.39±7.51 42.58±6.57 4.696 0.000 pH 值7.36±0.83 7.39±0.94 0.144 0.886

2.6 重症肺炎组中不同NLRP3 表达水平的患者28 d 累积生存率的比较

重症肺炎组中NLRP3 高表达和低表达患者28d 累积生存的K⁃M 曲线见图2，死亡总人数13人，其中NLRP3 高表达患者死亡10 人、NLRP3 低表达患者死亡3 人。经log rank 检验，重症肺炎组中NLRP3 高表达患者的28 d 累积生存率均低于NLRP3 低表达患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 重症肺炎组中不同NLRP3 表达水平患者28d 累积生存的K⁃M 曲线Figure 2 K⁃M curve of 28d cumulative survival of patients with different NLRP3 expression levels in severe pneumonia group

3 讨论

重症肺炎的救治难度大、预后差、死亡率高［5⁃6］，因此需要早期识别、尽早治疗。炎症反应的过度激活是重症肺炎发生发展过程中重要的病理生理变化之一炎症细胞因子的大量释放会损伤肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞，进而影响肺泡换气功能，最终造成低氧血症的发生［7⁃8］。此外，大量释放的炎症细胞因子还能进入血液循环，造成全身炎症反应激活及多脏器功能损害［9⁃10］。

NLRP3 炎症小体在炎症反应级联放大激活中的调控作用受到广泛关注，该小体由NLRP3、ASC及Caspase⁃1 组成，NLRP3 是一类模式识别受体、与病原菌结合后在细胞内招募ASC 并使Caspase⁃1发生活化，活化的Caspase⁃1 将IL⁃1β、IL⁃18 的前体裂解为具有促炎生物学活性的成熟体，进而参与炎症反应级联放大的过程［11⁃13］。肺炎支原体毒素刺激、PM2.5 暴露对单核细胞、肺组织中NLRP3 炎症小体具有激活作用［14⁃15］；放射性肺炎、呼吸机相关性肺炎患者外周血中NLRP3 炎症小体的表达增加［16⁃17］。以上结果提示NLRP3 在肺部感染的发生发展过程中起重要作用。本研究的观察结果显示：重症肺炎患者和普通肺炎患者外周血中NLRP3、ASC及Caspase⁃1 的表达水平均较健康者升高，提示肺炎发病过程中NLRP3 炎症小体过度激活，这与国内房有福的研究结果一致［18］；进一步比较显示重症肺炎患者外周血中NLRP3、ASC 及Caspase⁃1 的表达水平均高于普通肺炎患者，表明在普通肺炎向重症肺炎进展的过程中NLRP3 炎症小体发生了进一步活化。在此基础上本研究还通过ROC 曲线分析证实外周血NLRP3、ASC 及Caspase⁃1 的表达水平对普通肺炎和重症肺炎具有鉴别价值，这是本研究的创新点之一。

本实验结果显示：重症肺炎患者和普通肺炎患者的血清IL⁃1β、IL⁃18 含量均高于健康者且重症肺炎患者的血清IL⁃1β、IL⁃18 含量更高，且重症肺炎患者外周血中NLRP3、ASC、Caspase⁃1 的表达水平与血清中IL⁃1β、IL⁃18 的含量呈正相关，提示在普通肺炎向重症肺炎发展的过程中IL⁃1β、IL⁃18的异常释放与NLRP3 炎症小体的活化有关。

为了进一步深入认识NLRP3 炎症小体在重症肺炎发生发展中的作用，本研究分析了NLRP3表达水平与重症肺炎病情及预后的关系。WBC、hs⁃CRP、PCT 等感染指标以及PaO2、PaCO2等血气指标用于临床评估重症肺炎的病情，本研究的分析结果提示NLRP3 表达增加加重了重症肺炎感染程度及缺氧程度。同时本研究还通过28 d 生成的情况评估了重症肺炎患者的预后，NLRP3 高表达患者的28d 累积生存率较低表达患者降低，表明NLRP3 表达增加使重症肺炎的预后恶化。

综上所述，重症肺炎患者外周血中NLRP3 炎症小体表达增加；高表达的NLRP3 炎症小体与重症肺炎病情加重、预后不良有关。