PUMA基因在急性髓系白血病患者表达水平及与预后的相关分析

林樟萍 王可环 赵莲 王小花 谭三阳

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是血液系统常见的恶性肿瘤，恶性程度高，预后不良［1］。目前，关于AML 的发病机制尚不明确，多与遗传学有关。AML 临床治疗仍以规范化化疗为主，但是临床实践发现AML 患者的预后存在较大差异［2］。随着近年来研究深入，AML 发生及发展可能与某些原癌基因存在较大的关联性，其中P53 上调凋亡调控因子（p53 up⁃regulated modulator of apoptosis，PUMA）受到高度关注。研究表明，PUMA 属于Bcl⁃2 蛋白家族，在多种肿瘤低表达，与诱导细胞的凋亡密切相关［2⁃3］。尽管目前包括AML在内的多种血液系统肿瘤中已证实PUMA基因高表达，然而PUMA基因与AML 患者的预后是否存在相关性尚未见临床报道。本研究探讨PUMA基因与AML 患者预后的相关性，以期为临床靶向性治疗AML 提供新的可能治疗靶点，改善疗效及预后。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选取2015年1月至2016年6月海南省妇女儿童医学中心收治的100 例急性髓系白血病患者为研究组，其中男68 例，女32 例；年龄平均（37.8±12.3）岁。根据AML 患者PUMA基因表达水平分为2 个亚组：低表达亚组，共76 例，PUMA基因表达标准为2⁃ΔΔCT≤1.2；高表达亚组，共24 例，PUMA基因表达标准为2⁃ΔΔCT＞1.2［4］。同时选取急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）患者骨髓标本100 例为对照组，男55 例，女45 例；年龄平均（40.3±15.4）岁。两组病例的纳入标准：①AML 以及ALL诊断依据WHO 制定的急性白血病分类及诊断标准（2016年）［4］；②骨髓细胞学检查、流式细胞学检验等明确诊断；③全部病例均为首次就诊，无激素使用病史；④临床资料无缺失。两组病例排除标准：①合并心、肺、肝、肾等严重脏器功能不全；②合并有肝癌、胃癌、肺癌等其他组织器官恶性肿瘤；③明确诊断为急性早幼粒细胞白血病（M3）；④研究期内患者家属自行放弃治疗及退出研究、中途转院等临床资料不完整者。2 组人群在性别、年龄、体质量指数（body mass index，BMI）、家族肿瘤疾病史等临床因素比较差异无统计学意义（P＞0.05）。所有受试者均签署知情同意书，本研究经过本院伦理委员会审核通过，受试者或家属签署知情同意书。

1.2 AML 化疗方案

AML 组患者根据分型不同分为：M1 25 例，M2 37 例，M4 15 例，M5 18 例，M6 5 例。本研究中所有AML 患者化疗方案均为高三尖杉酯碱+阿糖胞苷（HA）方案，即：HHT 2.5mg/（m⁃2.D），用7 d，静脉滴注；Ara⁃c 150 mg/（m⁃2.D），用7 d，静脉滴注。所有AML 患者均治疗3 个疗程。

1.3 试剂与仪器

红细胞裂解液、TRIzol 试剂（广东凯普生物科技公司）；cDNA 合成、荧光定量PCR 试剂盒（美国Sigma 公司）；PCR 引物（武汉博士德生物工程有限公司）；倒置相差显微镜（上海美谷分子）；低温高速离心机（北京卓立汉光仪器有限公司）；ABI 7900PCR 扩增仪（南京贝登医疗股份有限公司）。

1.4 分离骨髓单个核细胞

抽取骨髓后立即放入抗凝试管中，分离白细胞，加入红细胞裂解液，吹打混匀后静置10 min，1 000 rpm 速度离心5 min，吸除上清，PBS 洗涤沉淀。

1.5 RNA 提取及cDNA 合成

按照cDNA 合成试剂盒说明书操作，提取RNA 并合成cDNA，-20℃保存备用。

1.6 mRNA 表达

以GAPDH 作为内参，进行PCR 扩增。反应体系总体积为20 μL，反应条件：95℃预变性15 min；94℃30 s，60℃30 s，74℃30 s，共40 个循环；74℃延伸5 min，4℃保存。实时荧光定量PCR 结果采用2⁃ΔCt表示。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.7 疗效判断

比较AML 组的2 亚组患者接受3 个化疗疗程后疗效的差异。其中本研究AML 化疗的疗效判断标准为［5］：①完全缓解（complete remission，CR）：无贫血、出血、感染或白血病细胞浸润性表现；血红蛋白＞90 g/L，白细胞正常或减少，无未成熟细胞，血小板＞100×109/L；原始细胞和早期细胞骨髓中的幼稚细胞（或未成熟细胞）＜5%，正常红细胞和巨核系。②部分缓解（partial remission，PR）：临床、血液和骨髓3 个方面中的1 个或2 个方面骨髓不符合CR 标准；骨髓原始细胞和早期幼稚细胞＜20%。③无缓解（no remission，NR）：临床、血液和骨髓方面未能满足CR 骨髓中的原始细胞和早期幼稚细胞＞20%，包括无效患者。

1.8 随访

所有AML 患者均出院后予以随访，随访方式为血液科主治医师门诊或电话随访，随访间隔为2月，随访终点为出院后3年或患者死亡，随访时间8～36月，平均（19.4±10.5）月。

1.9 统计学分析

使用SPSS 21.0 软件进行统计分析，符合正态分布的定量资料数值以（）表示，采用成组t检验；各分型间PUMAmRNA 表达量比较采取单因素方差分析，组间比较采取LSD⁃t检验。定性资料采取n（%）表示，采用χ2检验。采用Kaplan⁃Meier法绘制总生存期（overall survival，OS）曲线。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PUMA 基因在AML 中相对表达水平的比较

AML 患者PUMA基因阳性率低于对照组（P=0.024），AML 患者PUMA基因mRNA 表达量低于对照组（P=0.013），差异有统计学意义。见图1。

图1 两组PUMA 基因相对表达水平的比较Figure 1 Comparison of the PUMA gene expression levels between 2 groups

2.2 PUMA 基因在AML 各亚型中表达

PUMA基因阳性表达率从高到低顺序M2＞M1＞M5＞M4＞M6，差异有统计学意义（P=0.042）。PUMA基因mRNA 表达量高低从高到低顺序为M2＞M1＞M5＞M4＞M6，差异有统计学意义（P=0.038）。见表2。

表2 PUMA 基因在AML 各亚型中表达水平比较［n（%），（±s）］Table 2 Comparison of the PUMA gene expression levels among different types［n（%），（±s）］

表2 PUMA 基因在AML 各亚型中表达水平比较［n（%），（±s）］Table 2 Comparison of the PUMA gene expression levels among different types［n（%），（±s）］

类型M1 M2 M4 M5 M6 n 25 37 15 18 5 PUMA 基因阳性率20（80.00）30（81.08）10（66.67）14（77.78）3（60.00）PUMA 基因mRNA 表达水平0.23±0.03 0.27±0.02 0.16±0.01 0.19±0.02 0.15±0.06

2.3 AML 患者2 亚组疗效比较

PUMA基因高表达AML 患者的临床疗效显著高于PUMA基因低表达AML 患者，差异具有统计学意义（P=0.012）。见表3。

表3 AML 患者不同PUMA 基因表达水平亚组的疗效指标比较［n（%）］Table 3 Comparison of the effective indexes between 2 sub⁃groups in AML patients［n（%）］

2.4 不同PUMA 表达水平的AML 患者的生存分析

Kaplan⁃Meier 生存分析表明，随访3年PUMA高表达的AML 患者OS 优于PUMA低表达的AML患者，差异有统计学意义（P=0.018）。见图2。

图2 不同PUMA 表达水平的AML 患者的生存分析Figure 2 The curves of OS of different PUMA gene expression levels in AML patients by survival analysis

2.5 PUMA 基因表达和预后的关系

M1、M2、M4、M5 及M6 各类型AML 患者生存率比较差异无统计学意义（P=0.157），但同一类型AML 患者PUMA基因高表达的生存率高于PUMA基因低表达患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 各类型以及同一类型PUMA 基因表达水平不同的AML 患者预后比较［n（%）］Table 4 Comparison of the prognosis among different types of AML and between different PUMA gene expression levels in the same type of AML［n（%）］

PUMA基因高表达AML 患者的生存率高于PUMA基因低表达患者，比较差异有统计学意义（P=0.016）；PUMA基因高表达患者的化疗后感染（P=0.047）、化疗后复发发生率（P=0.007）低于PUMA基因低表达患者，比较差异有统计学意义；PUMA基因高表达与低表达的AML 患者髓外浸润发生率比较差异无统计学意义（P=0.191）。见表5。

表5 AML 患者不同PUMA 基因表达水平的预后指标比较［n（%）］Table 4 Comparison of the prognosis between different PUMA gene expression levels［n（%）］

3 讨论

AML 的发病机制较为复杂，目前认为至少包括癌基因的激活、抑癌基因的失活、信号转导通路的调控等机制。而抑制肿瘤细胞的增殖，促进凋亡是治疗恶性肿瘤的常用方法，因此寻找一种新型治疗靶点成为目前研究的热点。最近PUMA基因作为一种新发现的促进凋亡基因受到临床研究关注。大量研究证实，人类多种肿瘤组织中存在PUMA基因表达减少，促进了肿瘤的发生发展［5⁃9］。有研究表明，人胃癌细胞中PUMA基因低表达，且PUMA基因与肿瘤细胞的增殖、浸润和迁移呈负相关［10］。Yan 等学者［11］发现，正常口腔黏膜组织PUMA基因表达阳性率高于口腔癌细胞，与口腔癌生物学行为密切联系。朱海嘉等［12］研究表明，PUMA基因mRNA 在AML 患者表达量低于对照组人群。Obexer 等［13］研究提示，尽管慢性淋巴细胞白血病患者与健康对照体内PUMA表达水平无显著统计学差异，但与患者PUMA表达水平与预后存在相关性。

由于急性早幼粒细胞白血病（M3）的临床治疗措施与其他类型AML 患者存在显著差异，因此M3患者应单独进行研究分析，故本研究纳入的研究对象排除M3 患者。本研究结果提示PUMA基因在AML 细胞生长过程中起到促进凋亡作用，显著缩短了肿瘤细胞的生存时间，抑制了肿瘤细胞恶性增殖。这一结果与既往研究是一致的［4］。同时结果也显示，PUMA基因作为重要的抑癌基因，其基因低表达可能与AML 的发生有关。进一步分析结果显示，不同AML 亚型患者体内的PUMA基因阳性表达率以及基因mRNA 表达量均存在较大的差异，提示不同AML 亚型在相同化疗药物治疗时疗效存在差异可能与PUMA基因水平差异有关，但待于进一步研究予以证实。本研究结果提示PUMA基因可能与AML 患者对化疗药物敏感性存在相关性，这也值得进一步深入研究分析。有研究表明，PUMA基因表达水平与慢性淋巴细胞白血病多种预后因素存在相关性，在预测患者预后中发挥重要的作用［14⁃15］。而本研究应用Kaplan⁃Meier生存分析证实，尽管M1、M2、M4、M5 及M6 各类型AML 患者预后无显著差异，但是对于同一类型AML 患者而言，PUMA基因高表达的患者预后优于PUMA基因低表达患者，并且PUMA基因高表达的所有类型AML 患者OS 更高，这均证实PUMA基因高表达的AML 患者中短期预后更好。

综上所述，PUMA基因在AML 患者骨髓中低表达，与患者的预后相关，PUMA基因为AML 的诊治提供新思路。但本研究仅分析单个PUMA基因，并未对其他靶基因与相关信号通路进行研究，这也将是今后需要进一步深入探索的方向。