日照市规模牛羊场人畜共患病净化监测

刘玉洁 韩勇

（山东省日照市动物疫病预防控制中心 276800）

2021 年8 月2 日，山东畜牧兽医局印发《山东省重点动物疫病监测净化工作方案（2021 版），要求推进全省重点动物疫病监测净化，提高规模养殖场管理水平和疫病防控能力，推动动物疫病防控从稳定控制到净化消灭转变。2021 年10 月7 日，农业农村部下发《关于推进动物疫病净化的意见》，要求推进动物疫病净化工作，力争通过5 年时间，在全国建立一批高水平的净化场。

布鲁氏菌病（Brucellosis）又称马耳他热或波状热，是由布鲁氏菌（Brucella）引起的一种人畜共患自然疫源性传染病，布鲁氏菌常引起动物流产、不孕，故又被称之为传染性流产病[1]。我国农业农村部将其列为二类动物疫病，可感染人类及多种家畜和野生动物，引起相似的临床症状与病理损伤，如发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损害等，严重危害人类健康和畜牧业生产[2]。在世界动物卫生组织疫病名录中，牛结核病被列为B 类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。牛结核病的流行对养殖业及民众健康都会造成严重的危害[3]。炭疽杆菌是由炭疽芽孢杆菌引起的一种人畜共患传染病，卫生部门将其列为法定报告的乙类传染病，农业部门将其列为多种动物共患的二类动物疫病。

以上3 种疫病均为人畜共患病，能对动物和人造成严重危害，尤其是布病近年来在日照市人感染较多，为从源头控制疫病，日照动物疫病预防控制中心选择2 家奶牛场，6 家羊场，通过2 年持续监测，了解布氏杆菌、结核分枝杆菌和炭疽杆菌病原感染状况，为净化提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 样品类型和数量

选择8 家规模牛羊场，其中奶牛场2 家，羊场6 家（3 家免疫布病疫苗，3 家未免疫布病）。按照置信水平95%，预期流行率6%，每次采样不少于50 份。每头奶牛采集血清、抗凝血。每只羊采集血清。每个牛羊场采集环境拭子10 份（见表1）。

表1 2020～2021 年采样情况统计（单位：个）

1.2 样品采样和处理方法

1.2.1 血清

每头牛羊用促凝血管采集血5ml，室温静置30min 后，3000r/min 离心3～5min，取上层血清1～1.2ml 放1.5ml 离心管中，在离心管盖上编号。

1.2.2 抗凝血

每头牛用颈静脉或尾静脉采血，加入肝素抗凝剂采集血3ml，颠倒混匀3～5 次，室温静置30min 后在采样管上编号。

1.2.3 环境拭子

采集牛羊场环境样品，采集至少3 个畜舍、粪污处理点、饲料储存点等高风险区10 份样品。

1.3 检测试剂和方法

布病竞争ELISA 试剂盒、结核γ-干扰素ELISA 试剂盒购自武汉科前公司。布病虎红平板凝集抗原购自哈药集团。炭疽荧光PCR 试剂盒购自北京世纪元亨公司。牛型、禽型结核菌素购自瑞士BOVIGAM。

1.4 主要仪器设备

自动核酸提取仪960 购自西安天隆公司，实时荧光定量PCR 仪购自美国ABI 公司，全波长酶标仪购自美国MD 公司，高速冷冻离心机购自Sigma 公司等。

1.5 方法

1.5.1 布氏杆菌

对3 家未免疫疫苗的羊场采用布病虎红平板凝集试验（RBT）和布病竞争ELISA（cELISA）进行检测。cELISA 检测阳性的确诊为阳性，RBT 检测阳性的再用cELISA 或布病试管凝集试验（SAT）进行确诊。对3 家免疫疫苗的羊场采集血清用RBT 和cELISA 进行免疫效果初筛，RBT 阳性的用cELISA或布病试管凝集试验（SAT）进行确定。RBT 和SAT 参照动物布鲁氏菌病诊断技术（GB/T18646-2018），cELISA 试验严格按照试剂盒说明书进行。

1.5.2 结核分枝杆菌

对两家规模牛场采用结核分枝杆菌γ-ELISA 试验和变态变态反应（PPD），任何一种方法检测阳性的诊断为阳性。结核分枝杆菌γ-ELISA 试验严格按照试剂盒说明书，PPD 按照动物结核病诊断技术（GB/T18645-2020）执行。

1.5.3 炭疽杆菌

对8 家规模牛羊场采集环境样品，提取病毒核酸，进行炭疽杆菌荧光PCR 检测，操作严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果与分析

2.1 病原学监测

由表2 可知2020～2021 年连续2 年对8 个牛羊场进行检测，仅在2020 年1 个羊场中检测出2 份布病样品。2021 年均未检测到布氏杆菌、结核分枝杆菌和炭疽杆菌，说明日照市净化成效显著。

表2 2019-2021 年场病原学场阳性率统计（单位：个）

2.2 布病免疫抗体检测情况

由表3 可知，2020～2021 年，对接受布病免疫的3 个羊场进行检测，2 个羊场布病免疫抗体水平均超过70%，达到保护要求，其中1 个羊场抗体水平低于70%，应适当调整免疫程序，提高抗体水平。

表3 布病疫苗免疫抗体水平统计（单位：份）

3 讨论

3.1 净化总体情况

根据2020～2021 年连续监测结果可知，8 个牛羊场，布氏杆菌、结核分枝杆菌和炭疽杆菌净化效果较好，仅有1 个羊场在2020 年检测出2 份布病样品。到2021 年，全市有5 家牛羊场通过省级“布鲁氏菌净化场”，畜间达到稳定控制标准，人间病例呈下降趋势。

3.2 检测方法优化

布病平板凝集试验（RBT）检测抗体是IgG 类，敏感性高，操作简单，但容易出现假阳性，在实际应用中常作为初筛手段。布病试管凝集（SAT）特异性高、敏感性高，耗时较长，常作为血清学确诊手段。布病平板凝集和ELISA 有一定的假阳性率，试管凝集有一定假阴性率[4]。竞争ELISA 方法操作精准，结果简明，可避免人为的误判[5]。在临床应用中，常需两种或两种以上方法相互配合。本次监测采用布病RBT、cELISA进行初选，SAT 进行确诊，净化效果显著。

本监测对400 份样品同时进行牛结核菌PPD 试验和γ-干扰素ELISA 试验，检测均为阴性。陈建豪对433 份样本用γ-干扰素ELISA 检测与皮内变态反应方法进行比对，两者敏感性为84%，特异性为96.81%，符合率为96.07%（416/433）[6]。朱建华等对29 头结核阳性牛同时进行牛结核菌素PPD 试验和γ-干扰素ELISA 试验，符合率82.6%[7]。由于PPD 存在游标卡尺测量误差等缺点，γ-干扰素ELISA 存在循环的γ-干扰素水平过高、使用药物等因素影响。本次监测采用PPD 和ELISA 联合监测净化，效果更好。

3.3 下步工作重点

经过2 年持续监测，8 个牛羊场布氏杆菌、结核分枝杆菌和炭疽杆菌净化效果较好，仅有1 个羊场在2020 年检测出2 份布病样品，以上条件说明日照市牛羊场具备开展布氏杆菌、结核分枝杆菌净化条件。布氏杆菌仍在2020 年检出1 个场检出病原阳性，说明日照市布病仍存在风险。下一步要继续采取消毒、生物安全措施，做好净化工作。