绝经后骨质疏松患者骨组织中miR-124-3p、miR-328-3p、miR-338-3p的表达

牟朋林，麦彩园，曹燕明，王 斌 (.广州新海医院，广东 广州 50080；.广东省妇幼保健院，广东 广州 5000；.广州医科大学附属第二医院，广东 广州 5060；.佛山市三水区人民医院，广东 佛山 5800)

骨质疏松症(OP)是常见的代谢性骨疾病，其特点为骨量及质量、骨强度下降[1]。当前我国骨质疏松症患者数量超过了7 000万，50岁以上女性患病率为20.7%[2]，OP在绝经后妇女的发病率为未绝经女性的2～3倍[3]。OP的发病率逐年升高，已经成为世界范围内重大的健康-经济-社会问题[4]。破骨细胞(OC)和成骨细胞(OB)使骨骼处于重塑状态并维持正常的结构与功能[5]，它们维持的平衡被打破时骨构建功能会异常，骨质疏松或骨代谢疾病等将发生[6]。MicroRNA(miRNA)是一种非编码蛋白单链小分子RNA，已经在肿瘤、骨代谢等多个领域被广泛研究[7]。miRNA主要通过与靶基因的3'端非编码区结合，对靶因子产生负性调控作用，导致其降解或停止翻译，从而影响细胞的增殖、迁移、凋亡[8]。miRNA是可以调控骨髓间充质干细胞(BMSCs)向OB分化的，其对骨质疏松等相关疾病的治疗有重要价值[9]。史宏利等[10]分析证实miR-124-3p对BMSCs向OB的分化起调控作用。研究表明miR-328-3p、miR-338-3p可作为绝经后骨质疏松发生的生物标志物[11]。近年来，miRNA在MSCs及成骨与破骨中的生物作用越来越受到广泛的关注。本研究通过RT-qPCR方法分析检测骨组织中miR-124-3p、miR-328-3p、miR-338-3p在绝经后骨质疏松(PMOP)中的表达。

1 资料与方法

1.1研究对象及受试基本条件：本研究选择2020年1月～2021年9月在广州新海医院、佛山市三水区人民医院招募的绝经后妇女60例，分为对照组30例和PMOP组30例。患者伤前活动能力、完全民事行为能力正常，无精神及认知障碍，同意为本研究受试者，并且签署知情同意书等相关事项。本研究符合人体相关伦理学标准，并得到广州新海医院、佛山市三水区人民医院伦理委员会的批准。入院后登记姓名、年龄、身高、体重等各项资料，所有受试者检测骨密度(BMD)及T值，骨转换标志物β-CTX、PINP、N-MID-OT、25-羟维生素D[25(OH)D]， 雌二醇。

1.2入组标准

1.2.1PMOP组入组标准：满足前述条件；双能X线骨密度仪测骨密度T值≤-2.5，诊断为PMOP。

1.2.2对照组入组标准：满足前述条件；双能X线骨密度仪测骨密度T值≥-1.0。

1.2.3排除标准：伴有严重慢性疾病；引起继发性PMOP的内分泌性等代谢异常的疾病; 1年内接受药物或者激素治疗；有血液系统疾病不能行髂前上棘骨穿刺术；难以行髂前上棘骨穿刺术取到标本。

1.3标本收集：所有受试者行髂前上棘骨穿刺术，取松质骨骨组织≥300 mg，保存于液氮中，再转深低温冰箱(-80℃)中保存。采集空腹下外周静脉血，离心后血清放入深低温冰箱内保存。

1.4方法

1.4.1主要仪器及试剂：紫外分光光度计、PCR 仪、荧光定量PCR仪(美国伯乐公司)；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、引物(中国Takara公司)。

1.4.2RT-qPCR过程：①取骨样品：锤击，加液氮研磨，匀浆，移至1 ml RNAiso Plus液的EP管，混匀，加入氯仿0.2 ml，混匀，15～30℃孵育5 min。4℃下离心15 min，将上层水相移至无RNA酶离心管中，加异丙醇，孵育10 min，于4℃下离心10 min。移去上清液，加入1 ml的75%乙醇，混匀，4℃下离心5 min后弃去上清，室温干燥10 min。加入无RNA酶水40 μl获得RNA溶液，用DEPC水做空白标记，光度计检测读取OD比值介于1.9～2.0之间。②参照反转录试剂盒反转录将RNA合成cDNA：参照PCR试剂盒操作进行，在荧光定量PCR仪(Takara)上进行PCR反应。用Primer Premier5.0软件设计、Takara公司合成的引物(序列见表1)，反应体系:TaqMan®Fast Advanced Master Mix(2×)10 μl,TaqMan® Advanced miRNA Assay(20×)1 μl,cDNA反应液(1∶10 dilution)5 μl，Nuelease-free water 4 μl。按以下反应程度反应条件进行扩增：95℃预变性20 s；95℃ 1 s，60℃ 20 s，40个循环。选择U6做内参基因，使用qPCR仪自带Rotor-Gene Q Software进行计算所有样品的Ct值，用2-ΔΔCT表示PMOP组因子相比对照组因子表达变化的相对表达量。

表1 引物序列表

2 结果

2.1两组人群一般资料比较：两组人群年龄、身高、体重差异无统计学意义(P>0.05)；PMOP组患者BMD低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；而对照组T值>-1.0，PMOP组T值<-2.5，符合分组的规律。见表2。

表2 两组人群一般资料比较

2.2两组人群骨转换标志物比较：两组β-CTX、PINP、雌二醇差异有统计学意义 (P<0.05)；N-MID-OT、25(OH)D比较差异无统计学意义 (P>0.05)。符合以上指标在对照组、PMOP组的水平变化。见表3。

表3 两组人群骨转换标志物比较

2.3两组人群骨组织中miR-124-3p、miR-328-3p、miR-338-3p水平比较：PMOP组患者骨组织中的miR-124-3p、miR-338-3p表达水平高于对照组，miR-328-3p表达水平低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 两组人群骨组织中的miRNA的相对表达值水平比较

3 讨论

PMOP是由于女性绝经后体内雌激素水平迅速下降，OC导致的骨吸收大大增加，而OB未相应增加，导致骨吸收大于骨形成引起的代谢性疾病[12]。miRNA作为一种具有调控功能的非编码单链RNA大量存在于MSCs内，影响成骨、破骨细胞的增殖、迁移和分化等多种生物学功能过程[13]。近年来，miRNA对BMSCs分化及对OB、OC的影响已成为热点问题,miR-124-3p、miR-328-3p、miR-328-3p在PMOP调控成骨和破骨中发挥一定的作用[9-10,12]。

Qadir等[14]发现在人BMSCs的分化过程中miR-124-3p的表达改变可能影响了BMSCs的生物学功能。miR-124-3p通过抑制GSK-3β/β-catenin信号通路促进糖尿病骨质疏松大鼠骨髓间质成骨[15]，RANKL降低破骨细胞形成过程中miR-124的表达，miR-124降低破骨细胞前体的增殖和活力[16]。低骨量患者中血清miR-124-3p的增高可反映骨组织对绝经所致骨丢失的代偿机制-诱导骨丢失，促进成骨细胞分化[17]。有研究及数据库表明miR-124-3p在成骨中的作用靶点可能与Wnt信号通路有关，其中的Frizzled、LRP5/6、GSK-3β、Axin为可能的预测靶点[10,18-20]。本研究通过RT-qPCR方法分析检测miR-124-3p在PMOP组骨组织中的表达水平降低，说明其可通过减弱破骨、增强成骨促进PMOP。miR-124-3p可能通过某些靶点调控绝经后骨质疏松成骨、破骨分化，其作用靶点可能与Wnt信号通路的相关成骨因子、破骨RANKL因子有关。

Weilner等[21]研究表明miR-328-3p在骨质疏松性骨折患者血清中显著下降，ROC曲线分析显示了它具有较好的诊断价值，miR-328-3p可作为PMOP发生的生物标志物，其研究在脂肪来源的BMSCs中敲除miR-328-3p后，明显能抑制ALP活性和矿化能力，但其靶因子及具体机制不清。有研究[15]分析MSCs能够通过整合素吞噬凋亡小体，并利用凋亡小体来源的泛素连接酶RNF146和miR-328-3p来抑制Wnt通路的因子Axin1。缺乏凋亡的MSCs能够同时从外源凋亡小体中吞噬RN F146和miR-328-3p并阻断Axin1，从而影响Wnt通路。凋亡小体还转移miR-328-3p下调MRL/lpr MSC中Axin1的表达，而敲除miR-328-3p，但不包括其他Axin靶向微RNA，能部分废除凋亡小体的作用——对BMSCs功能受损可以起到相关作用。凋亡小体将E3连接酶RNF146和miR-328-3p转移到MSCs中的Axin1靶点并激活Wnt/β-catenin通路从而减少受损干细胞。Delic等[22]发现miR-328-3p能直接靶向Wnt抑制蛋白SFRP1从而激活Wnt通路，促进胶质细胞瘤侵袭能力，而研究表明SFRP1蛋白对OB和OC的分化均有调控作用，是调控骨重建的一个重要因子[23-24]。Ishimoto等[25]发现CD44是miR-328-3p的一个靶因子，有研究敲除CD44能显著抑制OC活性[26]。本研究通过RT-qPCR方法分析检测miR-328-3p在PMOP组骨组织中的表达水平降低，其可能通过某些靶点调控绝经后骨质疏松成骨、破骨分化，其作用靶点可能与Wnt信号通路的相关因子、凋亡小体与BMSCs的相互作用有关。

研究显示在OP中miR-338-3p 可以通过靶向于RANKL，从而抑制糖皮质激素诱导破骨细胞生成[27]。miR-338-3p 通过靶向作用Runx2负向调控BMSCs成骨分化,从而引起骨质疏松的发生[28]。过表达miR-338-3p明显抑制OC活性,且使OC活性标志物表达显著下调[29]。本研究用RT-qPCR检测miR-338-3p在PMOP组骨组织中的表达水平升高，说明其可通过减弱成骨、增强破骨促进PMOP，符合miR-338-3p通过影响OB和OC的靶点调控绝经后骨质疏松成骨、破骨分化。

综上所述，本研究miR-124-3p、miR-328-3p、miR-338-3p在PMOP组骨组织中表达水平变化明显，其可通过Wnt等靶点、相关因子调节成骨、破骨，影响PMOP。以上miRNA作为疾病的生物标志物不仅具有诊断价值，而且其本身或相关因子也可能成为新药开发的作用靶点，本研究可为PMOP患者诊治及研究提供相关依据。