枇杷清肺饮基于MAPK/NF-κB 信号通路调控HaCaT 细胞炎性损伤机制研究①

韩晓晴 吴景东 侯殿东 张小卿 王靓怡 （辽宁中医药大学，沈阳 110000）

痤疮又称粉刺，是一种毛囊皮脂腺阻塞引发的慢性炎症性疾病，各年龄段均可患病，青少年发病率较高，近年来发病年龄有向中年波及的趋势，痤疮是一种损美性疾病，让患者承受经济压力的同时，也带来一定的心理负担［1-2］。临床数据研究表明，在西医治疗痤疮的基础上配合中医辨证治疗，能取得更好的治疗效果，经方枇杷清肺饮源自《医宗金鉴》，临床上用来治疗肺经风热型痤疮，取得了较好的临床效果［3-5］。中医药治疗疾病具有多成分、多靶点、多途径的特点，目前针对枇杷清肺饮治疗痤疮的机制尚未完全阐明，本研究采用LPS 诱导HaCaT 细胞构建体外炎症模型，通过网络药理学与体外细胞实验验证揭示枇杷清肺饮治疗痤疮的作用机制，为中医药治疗痤疮提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料 人永生化表皮细胞HaCaT（武汉典藏中心，1101HUM-PUMC000373）；枇杷清肺饮（辽宁中医药大学附属医院）；DMEM 高糖培养基（Gibco 公司）；大鼠血清（北京斯贝福公司）；LPS（Aladdin 公司）；PBS（双螺旋公司）；CCK-8（碧云天有限公司）；TNF-α、IL-1β、IL-4、ELISA检测试剂盒（万类生物有限公司）；AKR1B1 ELISA检测试剂盒（酶联生物公司）；TRIpure、Super M-MLV 反转录酶、RNase inhibitor、2×Power Taq PCR MasterMix 及SYBR Green 试剂（北京BioTeke 公司）；NF-κBp65 抗体、P38 抗体、JNK 抗体、p-JNK 抗体、p-P38 抗体（美国CST 公司）；羊抗兔IgG-HRP（美国Thermo 公司）；内参抗体GAPDH（Bioss公司）；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；ELX-800酶标仪（BioTek 公司）；倒置相差显微镜（麦克奥迪公司）；CO2培养箱（上海力申公司）；紫外分光光度计（美国Thermo公司）；荧光定量PCR仪（韩国BIONEER公司）；双垂直蛋白电泳仪及凝胶成像系统（北京六一公司）。

1.2 方法

1.2.1 枇杷清肺饮与痤疮共同靶点筛选 以化合物类药性（drug-likeness，DL）>0.18，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）>30%为条件，使用中药系统药理学数据库与分析平台（简称TCMSP）筛选枇杷清肺饮中的中药化学成分，获取药物的活性成分。利用Uniprot 数据库筛选并建立药物活性成分靶点数据集。在数据库Genecards（https：//www.gen⁃ecards. org/）中检索痤疮（acne）相关基因。采用Draw Venny Diagram 在线程序（http：//bioinformatics.psb. ugent. be/webtools/Venn/）取枇杷清肺饮和痤疮靶基因交集，获得枇杷清肺饮与痤疮的共同靶点。

DL 和OB 是评判药物有效利用度的相关指标，一般认为OB≥30%且DL≥0.18 的药物化学成分可被认为是该药物的有效成分［6］。

1.2.2 药物间交集化合物及蛋白质相互作用（PPI）网络 通过药物Venny图得出各药物间的交集化合物。将枇杷清肺饮与痤疮共同靶点基因提交至String 网站（https：//string-db.org/），生成PPI 网络，采用Cytoscape软件进行可视化处理分析。

1.2.3 GO 生物学过程富集分析与KEGG 信号通路富集分析 导入交集靶点，利用R3.6.0 软件，安装colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview 等程集包，获取交集基因的生物功能及其在信号通路中的作用；对靶点进行GO 分析，获得条图、气泡图；进行KEGG分析，获得条图、气泡图及关键信号通路图（只展示前20条统计学最显著的结果）。

1.2.4 疾病-化合物-靶标-通路网络的构建 结合枇杷清肺饮与痤疮的共同靶点，以及KEGG 信号通路富集分析，构建疾病-化合物-靶标-通路网络，使用Cytoscape 3.7.2软件进行可视化处理分析。

1.2.5 HaCaT细胞体外验证

1.2.5.1 细胞培养及HaCaT细胞炎症模型 HaCaT细胞复苏后，加入含10%FBS的DMEM 培养基，当细胞生长密度为90%左右，细胞正处于对数生长期时，状态良好，可传代培养。依据文献选用20 μg/ml 的LPS刺激HaCaT细胞，模拟痤疮炎症模型［7］。

1.2.5.2 CCK-8 法检测不同浓度枇杷清肺饮含药血清及LPS对HaCaT细胞活性的影响 消化正常的HaCaT 细胞并计数，将细胞密度调整为1×104个/ml，每孔100 μl 的细胞悬液接种于96 孔培养板，37 ℃、5%CO2培养箱培养。除去正常组（250 μl 正常鼠血清）与对照组（250 μl正常鼠血清+20 μg/ml的LPS），设置8 组不同浓度含药血清实验组（组1：243.75 μl正常鼠血清+6.25 μl 枇杷清肺饮含药血清+LPS；组2：237.5 μl正常鼠血清+12.5 μl枇杷清肺饮含药血清+LPS；组3：225 μl 正常鼠血清+25 μl 枇杷清肺饮含药血清+LPS；组4：200 μl 正常鼠血清+50 μl 枇杷清肺饮含药血清+LPS；组5：175 μl 正常鼠血清+75 μl枇杷清肺饮含药血清+LPS；组6：150 μl正常鼠血清+100 μl枇杷清肺饮含药血清+LPS；组7：100 μl正常鼠血清+150 μl 枇杷清肺饮含药血清+LPS；组8：50 μl 正常鼠血清+200 μl 枇杷清肺饮含药血清+LPS），实验中每组设置5 个复孔，接种24 h 后进行细胞加药，将加药后的细胞培养板置于37 ℃培养箱中。分别培养24 h 后向96 孔板中加入CCK-8 溶液10 μl 混匀，将培养板置于37 ℃培养箱中孵育1 h后检测OD450值。

1.2.5.3 细胞分组 依据不同浓度枇杷清肺饮含药血清及LPS 对HaCaT 细胞活性影响结果，将细胞分为5 组，A 组为正常对照组，B 组为LPS 模型组，C 组为枇杷清肺饮低剂量干预组（225 μl 正常鼠血清+25 μl枇杷清肺饮含药血清+LPS）、D组为枇杷清肺饮中剂量干预组（200 μl 正常鼠血清+50 μl 枇杷清肺饮含药血清+LPS）、E组为枇杷清肺饮高剂量干预组（175 μl 正常鼠血清+75 μl 枇杷清肺饮含药血清+LPS）。

1.2.5.4 ELISA检测IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α分离细胞培养上清液，-80 ℃保存待测。根据试剂盒说明书操作检测IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α含量。

1.2.5.5 qPCR 检测IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α mRNA表达 Trizol法提取总RNA，对样本进行反转录，然后进行qPCR。qPCR 方法如下：以cDNA 1 μl为模板，GAPDH 为内参，进行PCR 扩增。变性94 ℃2 min；变性95 ℃15 s，退火延伸60 ℃15 s，72 ℃15 s，40个循环为反应条件。每种样本每个基因进行4个复孔平行实验，反应结束后分析熔解曲线，确认扩增产物特异性，分析方法利用2-ΔΔCt法。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.5.6 Western blot 检测JNK、p-JNK、P38、p-P38、NF-κBp65 蛋白表达 以4 ℃、10 000 g 离心10 min，分离上清即为所得的蛋白质抽提物，制备标准曲线，待测样本蛋白抽提物1 μl与19 μl PBS缓冲液混匀，取上清液，BCA 法检测蛋白浓度。制备蛋白上样液后SDS-PAGE，转印至PVDF 膜，封闭后加入JNK、p-JNK、P38、p-P38 和NF-κBp65 孵育一抗，4 ℃过夜，洗膜后，孵育二抗（37 ℃60 min），ECL 底物发光，应用Image J软件分析实验结果。

1.3 统计学处理 SPSS25.0 软件对实验结果进行统计分析，以±s表示，组间比较用单因素方差分析，P<0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 枇杷清肺饮与痤疮靶标蛋白交集分析 TCMSP检索枇杷清肺饮中的化合物，筛选出主要活性化合物153 个（已删除重复值），将153 个活性成分输入Drugbank 中（剔除无靶点成分），得到枇杷清肺饮中潜在作用靶标304 个（已删除重复值）；GeneCards 数据库检索到acne相关靶点1 395个，采用Draw Venny Diagram 在线程序将枇杷清肺饮和痤疮靶基因取交集，得到靶点118个，枇杷清肺饮与痤疮共同靶点韦恩图见图1。

图1 维恩图和PPI网络确定枇杷清肺饮对痤疮作用的共有基因Fig.1 Common genes of PIPA Qingfei Yin on acne were determined by Venn diagram and PPI network

2.2 药物间交集化合物及蛋白质相互作用网络枇杷清肺饮中药重合韦恩图见图2。结合化合物-靶标-KEGG-疾病网络及图2，对获取的153 种具有相关生物活性的化学成分进行分析，其中有较多作用靶点的成分主要有MOL000098（槲皮素）、MOL000422（山奈酚）、MOL003896（7-甲氧基-2甲基异黄酮）、MOL004328（柚皮素），其可能是枇杷清肺饮发挥治疗作用的重要成分。

图2 枇杷清肺饮药物重合韦恩图Fig.2 Overlapping Wayne diagram of PIPA Qingfei Yin

分析结果可知，蛋白相互作用网络中含118 个节点。拓扑分析所得数据发现VEGFA（血管内皮生长因子A）、IL-4、PTGS2（前列腺素内过氧化物合酶）、TP53（P53 基因）、TNF（肿瘤坏死因子）、EGFR（表皮生长因子受体）、ESR1（雌激素受体1）、AKR1B1（重组人醛糖还原酶）和IL-1β 的节点度排名靠前，这些蛋白主要在炎症反应、细胞增生、细胞凋亡和雌激素受体等方面发挥作用，提示其可能是枇杷清肺饮治疗痤疮的重要作用靶点。蛋白相互作用网络见图3。

图3 枇杷清肺饮治疗痤疮相关靶点的PPI网络Fig.3 PPI network of PIPA Qingfei Yin in treatment of acne related targets

2.3 功能富集分析 对枇杷清肺饮和痤疮共同靶点进行GO 功能分析，得到GO 条目1 922 个（P<0.05），其中生物过程（BP）条目1 750 个，细胞组成（CC）条目39 个，分子功能（MF）条目133 个，分别占比91.05%、2.03%、6.92%，各组排名前10的条目见图4。BP 条目中，排名前3 的为response to lipopoly⁃saccharide（脂多糖应答反应）、steroid metabolic pro⁃cess（类固醇代谢过程）、response to molecule of bac⁃terial origin（对细菌应激原分子的反应），提示枇杷清肺饮的靶点可能与调节细胞炎症与应激等密切相关。

图4 枇杷清肺饮与痤疮交集基因GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of PIPA Qingfei Yin and acne intersection gene

KEGG 富集筛选到131 条信号通路（P<0.05），这些通路主要与炎症信号通路、细胞因子相互作用和癌症信号通路等有关，说明枇杷清肺饮可通过多条通路发挥治疗痤疮的作用，尤其是PI3K/Akt 信号通路、MAPK信号通路和TNF信号通路，见图5。

图5 枇杷清肺饮与痤疮交集基因KEGG富集分析Fig.5 Enrichment analysis of KEGG gene between PIPA Qingfei Decoction and acne

2.4 疾病-化合物-靶标-通路网络的构建 将枇杷清肺饮治疗痤疮靶点和药物活性成分、KEGG 通路构建“疾病-化合物-靶标-通路”网络，使用Cytoscape软件对数据进行可视化。网络共有292个节点（1种疾病、153个活性成分、118个潜在治疗靶点、20条通路），枇杷清肺饮网络药理学分析发现1个化合物作用多个靶点，也存在不同化合物作用于1 个靶点的现象，这正是中医药多成分、多靶点的重要证据。枇杷清肺饮的疾病-化合物-靶标-通路图见图6。网络中倒三角代表KEGG 通路，左边同心圆代表中药活性成分（小圆形颜色复合表示复合多种中药活性成分），右边同心圆代表枇杷清肺饮治疗痤疮的靶点节点。

图6 活性成分-靶点-KEGG-痤疮相互作用关系Fig.6 Interaction between active ingredient-target-KEGGacne

2.5 HaCaT细胞体外细胞验证

2.5.1 HaCaT 细胞培养 HaCaT 细胞形态呈上皮细胞样，呈梭形及短梭形（图7），生长相对较快，接种后约2～3 d即可长满培养瓶底的90%，HaCaT的接种密度均为1∶2，生长2 d可传代1次。

图7 HaCaT细胞培养图（×100）Fig.7 Diagram of HaCaT cell culture（×100）

2.5.2 不同浓度枇杷清肺饮含药血清及LPS 对HaCaT 细胞活性影响 除正常组和对照组外，设置8 组不同浓度的含药血清为实验组，观察不同浓度枇杷清肺饮含药血清对HaCaT 细胞存活率的影响。结果表明，与正常组相比，加入LPS 后，对照组细胞OD 值显著增高，提示LPS 对细胞存活率有刺激作用。加入枇杷清肺饮含药血清后，含药血清分组的细胞OD 值显著降低，提示枇杷清肺饮含药血清对HaCaT 细胞存活率有抑制作用，考虑到枇杷清肺饮含药血清为25 μl、50 μl、75 μl 时，这3 组的细胞存活率差异无统计学意义（P>0.05），因此选定这3 组作为低、中、高剂量组浓度进行后续实验。见图8。

图8 不同浓度枇杷清肺饮含药血清及LPS 对HaCaT 细胞活性的影响Fig.8 Effects of different concentrations of PIPA Qingfei Yin containing serum and LPS on HaCaT cell activity

2.5.3 枇杷清肺饮对HaCaT 细胞IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α 表达的影响 由表2 ELISA 结果分析可见，与正常对照组细胞相比，LPS 可显著上调HaCaT细胞IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α 的表达；与LPS 诱导的HaCaT 细胞相比，枇杷清肺饮可显著下调IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α的表达。

表2 各组HaCaT细胞IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α表达比较（±s）Tab.2 IL-1β，AKR1B1，IL-4，TNF-α expressions comparison of HaCaT cells in each group（±s）

表2 各组HaCaT细胞IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α表达比较（±s）Tab.2 IL-1β，AKR1B1，IL-4，TNF-α expressions comparison of HaCaT cells in each group（±s）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with low dose group，3）P<0.05；compared withmiddle dose group，4）P<0.05.

TNF-α 40.32±9.80 142.35±8.291）134.48±2.75 77.96±12.712）3）49.62±8.252）3）4）Groups Normal Model Low dose Middle dose High dose IL-1β 97.12±22.72 333.04±38.881）279.69±28.902）200.38±7.242）3）145.82±18.782）3）4）AKR1B1 4.13±0.65 11.89±1.031）6.36±0.872）5.39±0.082）3）5.28±0.292）3）IL-4 23.60±2.49 78.00±3.431）59.70±6.732）38.12±7.672）3）30.18±5.012）3）

2.5.4 枇杷清肺饮对HaCaT 细胞IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α mRNA 表达的影响 由图9 qPCR 结果分析可见，与正常对照组细胞相比，LPS可显著上调HaCaT 细胞IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α mRNA 的表达；与LPS诱导的HaCaT细胞相比，枇杷清肺饮可显著下调IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α mRNA的表达。

图9 各 组HaCaT 细 胞IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF- α mRNA ΔCt均值对比Fig.9 IL-1β，AKR1B1，IL-4，TNF-α mRNA ΔCt mean comparison of HaCaT cells in each group

2.5.5 枇杷清肺饮对LPS 诱导的HaCaT 细胞中JNK、p-JNK、P38、p-P38、NF-κBp65 蛋白表达影响与正常对照组相比，LPS 可显著上调HaCaT 细胞中JNK、p-JNK、P38、p-P38、NF-κBp65蛋白表达；与LPS诱导的模型组相比，枇杷清肺饮含药血清可抑制P38-MAPK 和JNK-MAPK 的磷酸化以及NF-κBp65的蛋白表达，见图10。

图10 各 组HaCaT 细 胞JNK、p-JNK、P38、p-P38、NFκBp65蛋白表达Fig.10 Expressions of JNK，p-JNK，P38，p-P38 and NFκBp65 proteins in HaCaT cells of each group

3 讨论

枇杷清肺饮是由枇杷叶、桑白皮、黄连、黄柏、人参、甘草组成的经典名方，方中枇杷叶清泻肺热、桑白皮宣肺利气，合以黄连、黄柏清燥湿热，人参益气托毒外出，甘草调和诸药，是治疗肺经风热型痤疮的经方，相关临床试验均证实该方治疗痤疮有显著效果［8-9］，但枇杷清肺饮治疗痤疮的发病机制并没有深入的实验研究，故本研究应用网络药理学研究并预测其作用机制，并进行进一步的体外细胞实验验证。

网络药理学结果共获取153种具有相关生物活性的化学成分，其中有较多作用靶点的成分主要含MOL000098（槲皮素）、MOL000422（山奈酚）、MOL003896（7-甲氧基-2 甲基异黄酮）、MOL004328（柚皮素），提示以上成分可能是枇杷清肺饮发挥治疗作用的有效成分。

槲皮素具有调节脂质代谢、抗氧化等药理作用。痤疮发病机制与皮脂腺细胞的脂质分泌、代谢紊乱密切相关。在人原始脂肪细胞中，槲皮素具有抗炎、改善胰岛素抵抗的作用［10］。山奈酚具有良好的抗炎、抗癌、改善胰岛素抵抗等药理活性，研究表明，槲皮素、山奈酚通过抑制痤疮丙酸杆菌生长，增强红霉素的抗炎作用，从而发挥治疗痤疮的作用［11］。柚皮素的生物学作用广泛，具有抗炎、抗菌、清除自由基、抗氧化、抗癌、降血脂、解痉、预防和治疗肝病、抗动脉粥样硬化等作用［12］；由此枇杷清肺饮防治痤疮的活性成分主要通过抗炎、调节脂质代谢、抗氧化等发挥作用。

枇杷清肺饮与痤疮共同靶点PPI 网络中，发现VEGFA、IL-4、PTGS2、TP53、TNF、EGFR、ESR1、AKR1B1和IL-1β节点度值排名靠前，这些蛋白主要在炎症反应、细胞增生、细胞凋亡和雌激素受体等方面发挥作用；GO 功能富集分析结果得到BP 排名前3的条目为脂多糖应答反应、类固醇代谢过程、对细菌应激原分子的反应，提示枇杷清肺饮的靶点可能与调节细胞炎症与应激等密切相关；KEGG 富集筛选得到131条信号通路，前几条为PI3K/Akt信号通路、MAPK 信号通路、TNF 信号通路及IL-17 信号通路，与炎症信号通路、细胞因子相互作用及癌症信号通路等密切相关。根据网络药理学结果选定IL-1β、AKR1B1、IL-4、TNF-α 靶点蛋白，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路与NF-κB信号通路进行研究。

MAPK 信号通路在生长因子、炎症因子等各种刺激因素作用下，通过一系列激酶磷酸化级联反应，参与介导细胞的生长发育、氧化应激和凋亡等多种生理及病理过程［13］。根据信号通路激酶亚类的不同，MAPKs分为ERK1/2、JNK、P38和ERK5 4条信号转导通路。P38-MAPK 和JNK-MAPK 通过转化为磷酸化状态激活，以促进下游底物磷酸化来快速传递信号，MAPK 的激活能促进单核巨噬细胞产生IL-1α、IL-6 等炎症因子，在炎症反应中发挥关键作用［14-15］。

NF-κB是一种调节多种炎症反应表达的诱导性转录因子，研究显示有TNF-α、IL-6、IL-8 等至少27 种不同炎症反应靶基因可被NF-κB 激活，产生大量中性粒细胞浸润，聚集于炎症反应部位［16-17］。另外NF-κB 还可刺激IL-1β、TNF-α 等细胞因子表达，且细胞因子还可刺激NF-κB，进一步促进NF-κB 活化，使炎症反应持续、放大［18］。

IL-1β、TNF-α 等细胞因子均由单核-巨噬细胞产生，介导先天免疫，这些因子又称前炎症细胞因子，在固有性免疫应答反应的启动中发挥关键作用［19］。Th2 介导体液免疫，分泌IL-4、和IL-13 等细胞因子。Th1 和Th2 彼此之间通过分泌细胞因子进行相互调节和抑制，若Th1/Th2 分化失衡，则会引起细胞因子的分泌异常［20］。既往研究发现，抑制AKR1B1 后，NF-κBp65 入核比例明显下降，提示AKR1B1可影响NF-κB通路的传导［21］。

体外实验采用LPS诱导HaCaT细胞，建立HaCaT细胞炎症模型，发现枇杷清肺饮能不同程度地抑制HaCaT 细胞炎症模型中IL-1β、IL-4、TNF-α、AKR1B1 mRNA及蛋白的表达，抑制P38-MAPK和JNK-MAPK的磷酸化以及NF-κBp65 向细胞核内的转录。提示枇杷清肺饮可能通过作用于IL-1β、IL-4、TNF-α、AKR1B1 等靶点，调控NF-κB 和MAPK 信号通路发挥抗炎作用。