放流前大麻哈鱼幼鱼头肾和脾脏的组织学观察

李培伦，刘 伟，鲁万桥，唐富江，王继隆

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨 150070）

鱼类的免疫系统主要由免疫器官、免疫细胞及体液相关免疫因子构成，其中头肾和脾脏是鱼体重要的免疫器官和造血器官，也是抗体产生、中性粒细胞生成和红细胞发生的场所［1-3］。目前，国内外已有关于银鲳（Pampus argenteus）［3］、金头鲷（Sparus aurata）［4］、斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）［5］、驼背鲈（Cromileptes altivelis）［6］、四指马鲅（Eleutheronema tetradactylum）［7］等鱼类免疫器官形态组织结构的研究报道，指出不同种属鱼类物种之间其免疫器官在形态、大小及组织结构等方面存在着明显差异，也是长期进化过程中与其栖息生境条件相适应的结果［6］。同时，采用解剖学、组织学等方法研究鱼类免疫器官组织结构特征是临床诊断鱼类疾病的有效方法，也可为发展水产品健康养殖提供直观依据。

大麻哈鱼（Oncorhynchus keta），属鲑形目（Salmoniformes）鲑 科（Salmonidae）大 麻 哈 鱼 属（Oncorhynchus），俗称大马哈鱼、太平洋鲑、秋鲑等，其分布范围介于北纬35°—73°、东经120°—123°，为典型的溯河生殖洄游型冷水性鱼类，终生只繁殖一次，繁殖后亲本死亡［8］。中国境内大麻哈鱼仅分布于黑龙江、乌苏里江、图们江和绥芬河水域。近年来，由于人为捕捞强度大、全球气候变迁及修建各类水利工程等因素导致其生存空间萎缩、产卵场缺失、资源储量严重下降［9-11］。针对上述问题，中国政府有关部门每年4—5 月在大麻哈鱼的原始栖息水域积极开展人工增殖放流以恢复其种群资源，并取得显著成效［12，13］。目前，有关大麻哈鱼幼鱼的研究涉及生长特征［14，15］、盐度胁迫［16，17］、耳石标记［18］等方面，而有关其免疫器官形态组织学方面未见报道，本研究对放流前大麻哈鱼幼鱼的头肾和脾脏进行了形态结构观察，不仅能够丰富鱼类免疫器官形态结构相关资料，还可为探索大麻哈鱼放流苗种培育过程中鱼体免疫应答机理提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用大麻哈鱼幼鱼来自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所汤原大麻哈鱼孵化繁育基地，选取10 尾生长状况良好的个体作为试验样本，其叉长为（5.31±0.34）cm、体质量为（1.52±0.37）g。

1.2 试验方法

使用MS-222 型麻醉剂麻醉鱼体后测量其叉长、体质量，分别精确到0.01 cm 和0.01 g。解剖鱼体，将完整的脾脏置于波恩试液中，后取出消化道并切掉鱼体头部、尾部及背部肌肉，将剩余部分全部置于波恩试液中固定24 h，然后剥离头肾组织，将头肾和脾脏分别置入75%乙醇溶液中保存。

固定的头肾和脾脏组织经75%～100%乙醇溶液脱水后，二甲苯透明、石蜡包埋、SLEE 切片机切片（厚度6 μm），切片经二甲苯脱蜡后进行苏木精-伊红染色、乙醇溶液梯度脱水，二甲苯透明后中性树胶封片保存。Carl Zeiss 光学显微镜观察、SZSS2000 型显微拍照系统对组织进行拍照。

2 结果与分析

2.1 头肾的形态组织结构

大麻哈鱼幼鱼的肾脏形态为扁平长条形，位于消化道背上方，紧贴体腔背侧，前端膨大，可分为头肾和体肾两部分，其中最前端膨大为钉子状的是头肾，红褐色、稍扁平。此外，头肾在体腔内位于心腹隔膜前的食道背面、胸腔内咽退缩肌上方。大麻哈鱼肾脏中头肾与体肾之间无明显的区分界限，是一个连续的整体。

大麻哈鱼的头肾外层覆盖有一层致密结缔组织形成的被膜，深褐色，内含少量淋巴细胞、中性粒细胞等，头肾实质为网状结构，实质中无明显的小梁（图1a）。头肾实质主要由淋巴细胞聚集区、粒细胞聚集区、肾小管及血窦等组成（图1b）。淋巴细胞聚集区主要由大淋巴细胞和小淋巴细胞构成，其中小淋巴细胞体积较小、细胞质少，较大的细胞核几乎占据了整个细胞，嗜碱性强被染成深蓝色，与小淋巴细胞相比，大淋巴细胞的体积稍大、细胞质稍多。粒细胞聚集区主要由中性粒细胞组成，体积较大，多为圆形或不规则的圆形，细胞核较大且偏居一侧，细胞质几乎不着色。血窦组织明显，由聚集成片的红细胞、淋巴细胞及扁平细胞构成（图1b）。黑色素巨噬细胞无规律分散在肾实质中，巨噬细胞的细胞核大，几乎看不到细胞质，染色呈黄褐色，大量的巨噬细胞聚集在一起形成了黑色素巨噬细胞中心，呈光亮的黄褐色斑块儿（图1c、图1d）。头肾实质中能够明显看到少量肾小管及较多退化的肾小管，其中肾小管内壁为圆形的上皮细胞，排列整齐呈圆形或椭圆形，而退化的肾小管内上皮细胞排列疏松、肾管组织结构模糊（图1c）。头肾实质中静脉血管管腔较大，内含大量成熟和不成熟的红细胞，且在静脉血管壁周边看到了由排列紧密的肾上腺细胞聚集形成的小团状的肾上组织结构，肾上腺细胞胞体大而胞核小，且染色较浅（图1d）。

2.2 脾脏的形态组织结构

大麻哈鱼幼鱼的脾脏较小，为扁平不规则的椭圆状，位于胃组织的下方，肠道中部背面，颜色呈暗红色，表面光滑，背面稍凸，腹面平滑。大麻哈鱼幼鱼脾脏外具有一层较薄的被膜，主要由薄层结缔组织和一层扁平上皮细胞构成（图2a）。被膜以下为脾脏的实质部分，未见明显的脾小叶和脾小梁，但血管丰富，中央静脉及动脉血管可贯穿整个脾脏，其中静脉血管的管腔较大，但管壁薄，而动脉多附着于中央静脉血管边上，管腔较小，但管壁较厚，主要由平滑肌和扁平上皮细胞构成（图2b）。脾脏实质主要由分界不明显的红髓和白髓交替分布形成密集的网状结构，其中红髓区域所占面积较大，内含大量红细胞及少量淋巴细胞和巨噬细胞，而白髓所占面积较小，内含大量淋巴细胞和中性粒细胞，其中小淋巴细胞和中性粒细胞居多（图2a、图2c）。黑色素巨噬细胞较多，黄褐色，在脾脏实质中分布无明显规律，静脉、血窦、红髓等结构中均有（图2c、图2d）。脾实质中血窦较多，血窦主要由血细胞成片聚集而成，其形状、大小不一，相邻两个血窦之间为网状纤维组成的脾窦，无固定形态，而脾索分布于脾窦的周围，呈长短不一的条索状，由淋巴细胞、长杆形的内皮细胞及结缔组织组成（图2d）。

图2 放流前大麻哈鱼幼鱼脾脏的组织学结构

3 小结与讨论

3.1 头肾的组织特点和功能

鱼类的肾脏可分为头肾和体肾两部分，其中绝大部分鱼类的头肾在鱼体生长发育过程中会逐渐失去泌尿排泄功能，但却保持了发达的免疫功能和造血功能，如黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）［2］出膜后26～43 d 头肾中肾小管逐渐萎缩消失；2 月龄斑马鱼（Danio rerio）［19］头肾实质中的肾单位开始退化，1 龄时退化完全；草鱼（Ctenopharyngodon idella）［20］头肾在孵化后2 d 出现肾小管，6 d 出现造血干细胞及淋巴母细胞样细胞，85 d 肾小管完全消失，而成年弹涂鱼（Periophthalmus koelreuteri）［21］等少数鱼类的头肾中仍保留肾单位，无退化消失现象。大多数鱼类的头肾可分为3 个功能期，分别为单纯的泌尿功能期、泌尿与免疫混合功能期及单纯的免疫功能期［22］，而本研究中放流前大麻哈鱼的头肾实质中能看到肾小管及退化的肾小管，表明该时期大麻哈鱼幼鱼的头肾处于泌尿与免疫混合功能期。鱼类的头肾在形态结构上有所差别，大麻哈鱼的头肾与体肾之间无明显区分界限，是一个连续的整体，该结构特点与池沼公鱼（Hypomesus olidus）、花鲈（Lateolabrax japonicus）等［23］鱼类相同，与银鲳［3］、驼背鲈［6］、鲻（Mugil cephalus）［24］等鱼类的头肾和体肾被心腹隔膜分隔开不同。

大麻哈鱼头肾外周具有一层被膜，与驼背鲈［6］、鲻［24］等鱼类相似，不同于斜带石斑鱼［5］、花鲈［23］等鱼类的头肾外周仅有一层较薄的胶原纤维包裹。大麻哈鱼幼鱼头肾实质为网状结构，无明显小梁，含有淋巴细胞聚集区、粒细胞聚集区及血窦等，与驼背鲈［6］、四指马鲅［7］等鱼类的头肾结构相似。免疫细胞是机体参与免疫反应或与应答相关的细胞，分为参与特异性免疫反应的淋巴细胞和参与非特异性免疫反应的中性粒细胞、巨噬细胞等［25］。胡玲玲等［26］研究指出巨噬细胞内含有棕黄色颗粒和少量淋巴细胞，不仅能够参与免疫应答反应，又具有贮存血黄素、吞噬可溶性颗粒物质的功能。本研究中大麻哈鱼幼鱼肝脏实质中含有大、小淋巴细胞、中性粒细胞、棕褐色的黑色素巨噬细胞、堆积成块儿的黑色素巨噬细胞中心等功能较为齐全的各类免疫细胞，说明该时期的头肾在大麻哈鱼幼鱼参与免疫应答反应中发挥一定功能。此外，大麻哈鱼幼鱼头肾实质中含有大量静脉血管和血窦，内含成熟及未成熟的红细胞，表明头肾具有较强的造血功能。

3.2 脾脏的组织特点和功能

脾脏虽是鱼类胚胎发育过程中发育最晚的免疫器官，但其却是鱼体红细胞、中性粒细胞产生、储存的主要场所［3］。硬骨鱼类与软骨鱼类的脾脏结构差异较大，其中软骨鱼类的脾脏较大，造血功能强，实质分为界限清晰的红髓和白髓，而硬骨鱼类脾脏实质内的红髓和白髓是混合排列的且界限模糊，兼具免疫和造血功能［26］。大麻哈鱼幼鱼同大部分鱼类一样，肝实质中红髓与白髓混合排列，无明显界限，如银鲳［3］、鲻［24］等，不同于黄鳝（Monopterus albus）［27］等鱼类脾脏实质具有界限清晰的白髓。此外，大多数鱼类的脾脏外层都有一层薄的被膜，与脾脏实质内的网状结构组成脾脏支架，被膜结缔组织向实质内延伸形成脾小梁，但由于结缔组织中肌纤维不发达，故脾小梁结构不明显或没有。本研究中放流前大麻哈鱼幼鱼脾脏外具有一层较薄的被膜，无明显的脾小梁结构，与银鲳［3］、驼背鲈［6］、鲻［24］等鱼类相似，而与四指马鲅［7］等少数具有明显脾小梁结构的鱼类不同。

大麻哈鱼幼鱼脾脏内中央静脉及其周围的动脉发达，与此同时脾脏实质中血窦较多，均含有大量成熟和未成熟的红细胞，符合造血发育的特点，证实脾脏具有较强的造血及储血功能。研究表明，脾脏主要通过脾脏实质内的淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞发挥免疫功能，如草鱼［28］在拥挤胁迫条件下脾脏内的白细胞比容降低，许氏平鮋（Sebastes schlegeli）［29］受盐度胁迫后脾脏中的粒细胞结构发生了明显变化，推断放流前大麻哈鱼幼鱼脾脏中大量的淋巴细胞、中性粒细胞和黑色素巨噬细胞在免疫应答反应中发挥了重要作用。此外，大麻哈鱼幼鱼脾脏实质中黑色素巨噬细胞较多，静脉、血窦、红髓等结构中均有分布，部分巨噬细胞聚集成群形成黑色素巨噬细胞中心，可为血细胞的更新代谢提供有力保障，与驼背鲈［6］、鲻［24］、条石鲷［26］等鱼类相似，但与红笛鲷［25］、岩原鲤（Procypris rabaudi）［30］等鱼类脾脏中无明显的黑色素巨噬细胞中心不同，进一步证明了鱼类脾脏的组织结构存在种间差异。