铁、锰缺素胁迫对辣椒叶绿素荧光参数和反射光谱曲线的影响

白如月，耿 亚，王孝刚，刘志军

（1.南京信息职业技术学院电子信息学院，南京 210031；2.南京海康威视数字技术股份有限公司，南京 210031）

辣椒是中国最主要的蔬菜作物之一。随着设施农业技术的发展，温室辣椒无土栽培因其方便管理、防疫病、作物质量高、节约环保等优点，成为中国辣椒生产的重要方式［1，2］。由于辣椒生长速度快、产量高，生产中易忽视对基质微量元素的补充，势必造成辣椒微量元素缺乏，严重影响产量与品质［3，4］。作物微量元素缺乏症多数可通过外观作出诊断，而作物缺铁及缺锰均表现为叶片新叶的叶脉仍绿、叶脉间失绿，且铁锰双缺素复合症状较为复杂，病情相互影响和掩盖，在生产中难以鉴别［5-7］。针对作物微量元素的传统检测方法为化学分析法，但其流程繁琐、时效性差、成本高、损伤叶片，不利于作物缺素及时诊断及矫治［8］。

近年来迅速兴起的植物生理信息检测技术主要为叶绿素荧光技术及高光谱技术，叶绿素荧光被誉为植物光合作用的天然探针，与内部的光合过程密切偶联［9，10］；反射光谱曲线可通过不同波段的光谱反射率反映植物生长的重要信息［11，12］。叶绿素荧光技术及高光谱技术具有速度快、效率高、精确、无损等优点，广泛应用于农业品质鉴定、病害检测和估产的研究中［13，14］。本研究以辣椒为试验对象，采用智能温室水培法精准控制环境变量与铁、锰浓度，对缺铁、缺锰及铁锰双缺素处理的辣椒叶片叶绿素荧光动力学参数及叶片反射光谱曲线展开了研究，并建立了基于支持向量机（Support Vector Machine，SVM）的辣椒缺素类型诊断模型，旨在为使用现代物理技术和农业工程技术对温室辣椒铁、锰缺素的快速诊断提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验时间为2020 年6 月20 日至8 月1 日，试验地点为南京农业大学工学院的Venlo 温室，配有Eco-Watch（Dynamax）生态环境监测系统，实现对内、外遮阳、天窗及喷淋系统的监控。试验品种为凯瑟琳甜椒，使用普通水培以精准控制微量元素浓度，使用鹅蛋型透明水培容器，营养液选用日本山崎甜椒配方。所用分析纯药品有硝酸钾、硝酸钙、硫酸镁、磷酸二氢铵、硫酸锌、硼酸、硫酸铜和钼酸钠，铁、锰元素来源分别选用乙二胺四乙酸铁钠与硫酸锰，营养液电导率为1.1 mS/cm，使用气提式充氧法每天补充营养液氧含量15 min，每周更换一次营养液（图1）。使用仪器主要有MINI-PAM-Ⅱ叶绿素荧光仪、CI-720 光纤光谱仪、Spad-502 叶绿素仪、电导率仪等。

图1 水培辣椒

1.2 试验设计

随机选取30 株长势近似的幼苗为试验对象，进行不同的缺素处理。设置缺铁素组、缺锰素组、铁锰双缺组3 个控制组平行处理，每组均设50%（-Fe1、-Mn1、-FeMn1）、25%（-Fe2、-Mn2、-FeMn2）、0（-Fe3、-Mn3、-FeMn3）3 个水平，并设置对照组（CK，即不缺元素），共10 个处理，每个处理组2 株重复。辣椒生长过程中无其他环境胁迫。辣椒在处理一周后（6 月26 日）开始测量参数，SPAD 值、叶绿素荧光参数与反射光谱曲线每周测量一次，测量时间为夜晚20：00—23：00，以保证辣椒叶片充分暗适应及相同的LED 作用光环境，避免背景噪音对反射光谱曲线的影响。每株植物测量自顶部完全展开的3片新叶。

1.3 叶绿素荧光参数的测定

叶绿素荧光参数测量仪器为MINI-PAM-Ⅱ叶绿素荧光仪（WALZ，德国），设定饱和光为10（PDF约为6 000 μmol/L），作用光为5（PDF约为126 μmol/L），作用光稳定时间为3 min。所测叶绿素荧光原始参数为初始荧光（Fo）、光下最小荧光（Fo′）、最大荧光（Fm）、光下最大荧光（Fm′）、稳态荧光（Fa）；叶绿素荧光比值参数PSⅡ最大光化学量子产量（Fv/Fm）、PSⅡ实际光化学量子产量（Y（Ⅱ）），光化学猝灭系数（qL）和非光化学猝灭系数（NPQ）均由仪器自动计算得出；测定时，使用叶夹固定叶片的ROI 区域，叶片充分暗适应后，开启饱和脉冲获得暗参数，暗恢复30 s后使用作用光光化3 min，再次开启饱和脉冲测定光参数，最后打开远红光测定Fo′。测量时，选取每个叶片叶脉两侧及叶尖3 个位置取平均值。

1.4 反射光谱曲线的测定

反射光谱曲线使用CI-710 光纤光谱仪获取，波谱范围为400～1 000 nm，光学分辨率为2.0 nm，设定积分时间为600 ms，平均扫描次数为2。叶片测量区域与叶绿素荧光参数的测量区域保持一致，每次使用前，使用标准反射板标定CI-710。各高光谱特征参数包括花青素反射指数（ARI）、归一化植被指数（NDVI）、红边指 数1（VREI1）、光化学 植被指数（PRI）、植物衰减指数（PSRI）、变异的CAR指数（TCARI）、结构强化色素指数（SIPI）、红边归一化植被指数（RENDVI）、标准化叶绿素指数（NPCI）、胡萝卜素反射指数（CRI），且各参数可由软件自动计算得出。

1.5 数据分析方法

反射光谱曲线的处理与高光谱特征参数计算在CID-710 官方软件SpectraSnap 内进行，采用Excel 2015 和MATLAB 14.0 软件进行数据处理并作图，并利用SPSS Statistics 20.0 软件对数据进行显著性分析，采用Tukey HS 方法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 铁、锰缺素对辣椒叶片SPAD 值的影响

叶片SPAD 值是衡量叶绿素相对含量的参数，可表示植物的绿色程度。由图2 可以看出，对照组辣椒叶片在生长过程中SPAD 值逐渐增加，铁、锰缺素对SPAD 值的影响因缺素种类与缺素水平而异。在3 组缺素处理中，随着缺素水平的增加，缺铁、缺锰与双缺组叶片SPAD 值均呈下降趋势，下降程度为-FeMn＞-Fe＞-Mn。缺素处理14 d后，-Fe3、-FeMn2和-FeMn3 处理的SPAD 值显著低于CK（P＜0.05）。缺素处理21 d后，-Fe2、-Fe3、-Mn3、-FeMn2和-FeMn3处理的SPAD 值均显著低于CK，其中-Fe2、-Mn3、FeMn2 处理的SPAD 值分别为对照组的87.13%、83.67%和79.3%，黄化症状较为严重的-Fe3、-FeMn3处理的SPAD 值仅为对照组的50.33%和28.71%。说明辣椒叶片缺铁较缺锰造成的叶绿素含量下降更为严重，而铁锰双缺会明显加剧辣椒的黄化程度。在全部测量周期中，-Fe1、-Mn1、-Mn2、-FeMn1 处理的SPAD 值与对照组差异不显著。

图2 不同缺素处理对辣椒叶片SPAD 值的影响

2.2 铁、锰缺素对辣椒叶片叶绿素荧光参数的影响

随着处理时间的增加，缺铁、缺锰及铁锰双缺组0 水平的各叶绿素荧光参数表现出规律的变化，其他处理与CK 组的叶绿素荧光参数无明显变化，所以选择-FeMn3、-Mn3、-Fe3 3 个处理进一步分析。

由表1可知，辣椒叶片3个处理组的Y（Ⅱ）、Fv/Fm与NPQ在测量周期内均低于CK，且随着处理时间的增加，Y（Ⅱ）、Fv/Fm与NPQ波动式减小。辣椒叶片的Y（Ⅱ）在21、28、、35 d 时下降趋势为-FeMn3＞-Mn3＞-Fe3；Fv/Fm在14、21 d 时，下降趋势为-Mn3＞-FeMn3＞-Fe3，28 d 后 为-FeMn3＞-Mn3＞-Fe3；NPQ在14、21 d 时，下 降 趋 势 为-Mn3＞-Fe3＞-FeMn3，35 d 时为-FeMn3＞-Mn3＞-Fe3。部分处理时间，辣椒叶片-Fe3 处理和-FeMn3 处理的qL低于CK。

表1 不同缺素处理对辣椒叶片叶绿素荧光参数的影响

方差分析后发现，缺素处理7 d 前，各处理叶绿素荧光参数与对照组差异均不显著，-Mn3 处理的Fv/Fm与-FeMn3 处理的Fv/Fm、qL在缺素处理14 d 后与CK达到显著差异；-Fe3处理的Y（Ⅱ）、Fv/Fm，-Mn3处理的Y（Ⅱ）、NPQ和-FeMn3 处理的Y（Ⅱ）在缺素处理21 d 时与CK 达到显著差异。说明使用叶绿素荧光参数检测植物铁、锰缺素是可行的，但参数变化趋势较复杂，前期灵敏度不如后期高。

2.3 铁、锰缺素对辣椒叶片反射光谱曲线的影响

不同处理组的高光谱特征参数均出现了有规律的变化。如表2 所示，缺铁处理组的ARI、NDVI、VREI1、PSRI、SIPI、RENDVI、CRI，缺锰处理组的NDVI、VREI1、SIPI、RENDVI、CRI以 及铁 锰双 缺 组的ARI、NDVI、VREI1、PRI、RENDVI、SIPI、CRI均低于对照组（CK），且随着缺素水平的增加大体上呈下降趋势；缺铁处理组的TCARI，缺锰处理的TCARI、NPCI以及铁锰双缺组的TCARI、NPCI高于对照组；方差分析后发现，各处理组50%水平的光谱特征参数均未与对照组（CK）达到显著差异，25%水平中-FeMn2处理的VREI1、PSRI、RENDVI、NPCI和-Mn2 处理的NPCI与对照组（CK）差异显著，0 水平中除-Mn3 处理与CK 的PRI差异不显著外，各处理所有光谱特征参数均与对照组（CK）达到显著差异。说明高光谱特征参数能较好地响应植物铁、锰及其复合缺素胁迫。

表2 不同缺素处理对辣椒叶片高光谱特征参数的影响

缺素处理前期，各处理的反射光谱曲线差异不明显，缺素处理21 d 后，不同时期各处理的反射光谱曲线变化趋势基本一致，为此，主要取缺素处理21 d的样本反射率波形进行分析。图3 为各处理组不同水平的反射光谱曲线，可以看出，不同处理的反射光谱曲线波形基本相似，但在可见光波段（460～710 nm）的反射率值差异较大，在“绿峰”（550 nm 左右）处的反射率值差异最为明显。随着缺素水平的增加，各处理在可见光波段的反射率呈上升趋势，铁锰双缺对光谱反射率影响最大，缺铁次之，缺锰最小。缺铁与铁锰双缺会造成反射光谱曲线的“红边”向短波方向偏移，但各处理在红外波段（760～1 000 nm）的差异不显著。

图3 不同缺素处理对辣椒叶片反射光谱曲线的影响

2.4 基于SVM 的缺素类别诊断模型

利用LIBVM 3.1 工具箱进行SVM 分类建模，选用径向基函数（式1）作为模型的核函数，边界函数c和核宽度g采用交叉验证（Cross validation）法获取。随机选取各时期缺铁组、缺锰组与铁锰双缺组黄化叶片（SPAD＜40）样本各50 组，其中30 组作为训练集，20 组作为检验集。分别对样本SPAD、叶绿素荧光参数与光谱特征参数进行归一化处理，作为建立SVM 分类模型的特征参数。

式中，k为径向距离函数，x为空间某点；xc为核函数中心；g为核宽度。

由表3 可知，在2 种输入模式下，模型均对辣椒叶片缺素类型有很好的分类能力，SPAD+叶绿素荧光参数全分类准确率可达到90%以上，SPAD+光谱特征参数全分类准确率可达到85% 以上。以SPAD+叶绿素荧光参数作为输入在鉴别缺铁与铁锰双缺样本时有较高的准确率；以SPAD+光谱特征参数作为输入可更准确地鉴别缺铁与缺锰、缺锰与铁锰双缺样本。说明使用基于叶绿素荧光参数与光谱特征参数的SVM 模型诊断辣椒铁、锰缺素症是可行的。

表3 不同输入下SVM 模型对缺素类型的分类准确率

3 小结与讨论

铁元素与锰元素均为植物体内多种酶的组成部分，影响蛋白质、碳水化合物与脂类的合成，直接和间接参与光合作用的光能吸收、电子传递及干物质积累等过程，严重影响作物的生产质量。铁、锰缺素症的错误矫治不仅不利于恢复作物健康，甚至会造成铁、锰元素毒害。因此，结合现代物理检测手段及农业工程技术，对植物铁、锰缺素症作出快速、有效诊断是当务之急。

试验各控制组50%水平的每种参数均未与对照组达到显著水平，这与试验样本品种、试验环境和设备检测精度等因素有关。缺素叶片的SPAD 值降低，表明缺素植物的叶绿素合成受阻，铁锰双缺组同水平的SPAD 值显著低于缺铁组与缺锰组，说明在铁、锰复合缺素影响下辣椒受到了更为严重的胁迫。当叶片SPAD 值降至约40 以下时，可凭肉眼明显观察到辣椒叶片黄化症。

Y（Ⅱ）反映了光合机构在当前作用光（本研究中为126 μmol/L 蓝光）下的光能转化效率，Fv/Fm反映了植物的潜在最大化光能转化效率，在植物的胁迫检测中应用广泛。缺素处理后叶片的Y（Ⅱ）与Fv/Fm下降，说明叶片吸收的量子中参与PSⅡ光化学反映的比例下降，植物光合系统受到破坏。qL与NPQ分别表示PSⅡ积累量子中用于光合作用的部分和转化为热能的部分。缺锰处理的qL升高，可能原因是植物在缺锰胁迫下为提升光合作用作出的适应性反应，而当铁、锰复合缺素时该适应能力丧失，qL下降。缺素处理下NPQ下降说明植物光保护能力降低。叶片光谱反射率在可见光波段主要受叶绿素含量的影响，在红外波段则主要受叶片细胞结构的影响。随着缺素水平与缺素时间的增加，叶片在可见光波段的反射率呈上升趋势，且铁锰双缺组＞缺铁组＞缺锰组，这与SPAD 值的变化趋势一致。铁、锰缺素均未对红外波段的光谱反射率造成影响，说明叶片的细胞结构无明显变化。

支持向量机是一种以统计学理论为基础，以结构风险最小化为目标，实现对数据深层信息进行挖掘的新方法，在小样本回归分析和模式识别中表现出良好的准确性。在鉴别缺铁组与双缺组时，使用叶绿素荧光参数为输入的模型准确率较高；鉴别缺铁组与缺锰组、缺锰组与双缺组时，使用光谱特征参数为输入的模型准确率较高。说明缺铁与铁锰双缺叶片的光能吸收、传递、耗散、分配等过程差异较为明显，而缺铁组与缺锰组、缺锰组与双缺组的叶片表观性差异较为明显。因此，在实际应用时，应充分结合叶绿素荧光技术与高光谱技术各自的优点，从而对温室辣椒的缺素类型作出更准确的诊断。

本研究分析了温室辣椒缺铁、缺锰及铁锰双缺素对叶片叶绿素荧光参数与反射光谱曲线的影响，并使用支持向量机针对出现黄化的叶片建立了缺素种类快速诊断模型，证明使用叶绿素荧光技术与高光谱技术诊断温室辣椒铁、锰缺素症是可行的。