恩施地区三种重楼属植物活性成分与抗氧化活性研究

孙慧茹，谭生权，方昕悦，何美军，何银生，李 宇，张美德，杨 旭，4

（1.湖北省农业科学院中药材研究所，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大学生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000；3.恩施州中心医院，湖北 恩施 445000；4.湖北生态工程职业技术学院/林下经济湖北省工程研究中心，武汉 430200）

重楼为民间常用的名贵中药材，来源于百合科重楼属（Paris）植物，具有解毒、消炎、镇痛、凉肝定惊的作用［1］。现代药理学研究表明，重楼具有抗菌［2］、抗病毒［3］、止血［4］、驱虫［5］、抗肿瘤［6］、抗氧化［7］、抗心血管疾病［8］和免疫调节［9］等功效，是云南白药、宫血宁、季胜德蛇药片等中成药的主要原料［10］。重楼主要活性成分为甾体皂苷类化合物［11］，其中重楼皂苷Ⅱ是衡量药材质量的重要指标之一，具有较强的免疫调节作用和抗肿瘤作用［12］。

重楼属植物种类较多，但是目前药典中规定能药用的仅有七月一枝花［Paris polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara］、云南重楼［Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand-Mazz］的干燥球茎［13］。这是由于不同重楼属植物中的皂苷种类、皂苷含量以及抗氧化活性也有不同，直接影响重楼的抗肿瘤药用功效［14，15］。七月一枝花、云南重楼，这2 种药用重楼资源生长缓慢、产量低等瓶颈问题限制了其开发利用，通过筛选合适的替代药用重楼属物种是一种有效的解决办法。本研究通过改进的气相色谱法（GC），检测3 个不同种重楼七月一枝花、啟良重楼（Paris qiliangianaH.Li，J.Yang & Y.H.Wang）、黑籽重楼（Paris thibeticaFranch.）中活性成分含量，并评价3 种重楼提取物DPPH 自由基清除活性能力，为重楼属植物开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

5 年生啟良重楼、黑籽重楼、七叶一枝花药材采集于恩施周边地区，经湖北省农业科学院中药材研究所由金文高级农艺师鉴定。标准品重楼皂苷Ⅱ购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，乙酸乙酯（色谱纯）购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

DFY-1000 型中草药磨粉机（温岭市林大机械有限公司）；Aglient Technologies 7890A 型气相色谱仪配备氢火焰离子化检测器FID、G4513A16 位自动液体进样器、Agilent 19091S-433 型毛细管柱（HP-5MS 5% Phenyl Methyl Silox，30 m×250 μm）（安捷伦科技有限公司）；RE-200A 型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）。

1.3 气相色谱条件

检测器为FID 检测器。升温程序：0～3 min，保持60 ℃；3.00～73.33 min，60 ℃→280 ℃，升温速度3 ℃/min；73.33～93.33 min，保持280 ℃。进样口温度设置310 ℃，载气为氮气（99.999%），流速为1.0 mL/min。FID 设置温度为280 ℃，设置进样量为5 μL（分流比20∶1）。

1.4 溶液的制备

1）重楼皂苷Ⅱ标准品溶液配制，精密称取重楼皂苷Ⅱ标准品32.8 mg，置于2 mL 棕色容量瓶，加乙酸乙酯定容，配置成16.4 mg/mL 的标准品溶液母液。

2）用乙酸乙酯对16.4 mg/mL 的标准品母液进行稀释，得到浓度分别为16 400.0、8 200.0、4 100.0、2 050.0、1 025.0、512.5 ng/μL 的系列标准溶液。

3）供试样品溶液配制，将七叶一枝花、黑籽重楼、啟良重楼根茎洗净，60 ℃烘干，除须根后粉碎过65 目筛。按1∶50（m∶V）加入乙酸乙酯，500 W 超声辅助提取（25 ℃，30 min），抽滤，13 000 r/min 离心10 min，吸取上清液备用分析。

1.5 重楼皂苷Ⅱ含量GC 检测

标准品重楼皂苷Ⅱ线性关系考察，取“1.4”中稀释系列标准溶液，按“1.3”的色谱条件GC 检测进样上述系列标准溶液，每组样品进样6 次重复。测定仪器信噪比（S/N），S/N= 3 对应浓度为GC 检出限，S/N=10 对应浓度为GC 定量限。重复6 次进样标准品计算峰面积的相对标准偏差（RSD），测试重复性；系统进样配制的标准品6 个浓度样品，得到重楼皂苷II 的标准曲线和R2值；同一个样品重复6 次进样，计算含量的相对标准偏差（RSD），测试精密度；已知浓度样品添加已知标量，进样检测计算回收率（75%～120%）。采用GC 外标法检测重楼中重楼皂苷Ⅱ的含量，计算公式如下。

式中，Cx为重楼中重楼皂苷Ⅱ的含量（mg/g）；CR为GC 外标法检测浓度（μg/mL）；m为重楼干重（g）；V为样品溶解体积（mL）。

1.6 抗氧化活性

参照Sharma 等［16］的方法，并稍有改进：①配制母液，分别取七叶一枝花、黑籽重楼、啟良重楼的提取物加无水乙醇配制成浓度为100 mg/mL 的母液。②加无水乙醇稀释成系列浓度的重楼提取物溶液，稀释浓度为1 000、1 500、2 000、2 500 mg/L；③重楼提取物溶液试验组（Test Group，TG），取3 mL 重楼提取物样品溶液加入1 mL 浓度为200 μmol/L 的DPPH溶液混匀，置于水浴锅中，在30 ℃下避光反应30 min；对应设置，取3 mL 重楼提取物样品溶液加入1 mL无水乙醇溶液混匀，相同处理扣除背景吸收（Subtracting background absorption，SBA）。另设置抗坏血酸、DPPH 分别为阳性对照组（Positive control group，PCG）和空白组（Blank control group，BCG）。在517 nm下检测吸光度，计算样品清除DPPH 自由基的百分率（Clearance，CL）。

2 结果与分析

2.1 重楼属植物中重楼皂苷Ⅱ的鉴定

通过GC 检测重楼属植物样品，得到重楼皂苷Ⅱ（Rt）标准品的保留时间为69.783 min，与黑籽重楼、七月一枝花、啟良重楼3 个重楼属植物供试溶液中色谱峰的保留时间（69.773、69.779、69.776）min基本一致，如图1 所示。通过保留时间鉴定这3 个吸收峰为重楼皂苷Ⅱ。

图1 重楼样品与重楼皂苷II的色谱图

2.2 标准曲线的绘制和线性关系的考察

将浓度为16 400.0、8 200.0、4 100.0、2 050.0、1 025.0、512.5 ng/μL 重楼皂苷Ⅱ标准品溶液分别进样5 μL，用FID 检测器进行检测分析，测定各色谱峰的峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），以标准液溶液浓度（X）为横坐标，进行线性回归分析，得到重楼皂苷Ⅱ标准品的标准曲线为Y=0.845X+72.18，如图2所示，得到R2为0.999 5，重楼皂苷Ⅱ标准品溶液在浓度为512.5～16 400.0 ng/μL 时，线性相关性好。

图2 重楼皂苷Ⅱ的标准曲线

2.3 精密度与回收率试验

通过信噪比计算，得到检出限（DL）为40.5 ng/μL，定量限（QL）为130.6 ng/μL。通过标准曲线得到重楼皂苷Ⅱ的含量，再计算出其相对标准偏差值（RSD）为2.72%，结果见表1，RSD＜5%，可见此方法的精密度良好，可满足进一步分析的要求。

表1 标准品精密度试验结果（n=6）

加样回收率结果见表2，重楼皂苷Ⅱ的加样回收率为96.93%～98.33%，表明本方法准确可靠，可以满足测定的要求。

表2 回收率试验结果（n=3）

2.4 不同种重楼中重楼皂苷Ⅱ含量的比较

利用GC 外标法检测重楼属植物中重楼皂苷Ⅱ的含量，由表3 可知，3 种样品重楼皂苷Ⅱ含量存在明显差异，七叶一枝花为0.104 mg/g，黑籽重楼为0.098 mg/g、啟良重楼为0.015 mg/g，七叶一枝花与黑籽重楼的重楼皂苷Ⅱ含量显著大于啟良重楼。表明七叶一枝花中的活性成分重楼皂苷Ⅱ含量最高，其次是黑籽重楼，啟良重楼的含量最低。

表3 不同种重楼中重楼皂苷Ⅱ含量的比较（n=3）

2.5 抗氧化试验结果

3 种重楼提取物均有DPPH 自由基清除活性，在试验所选取的浓度范围内，3 种样品DPPH 清除能力都随浓度增加而增强，且七叶一枝花提取物DPPH自由基清除活性最强，其IC50为2.372 mg/mL，其次是啟良重楼和黑籽重楼，其IC50分别为2.461、2.473 mg/mL（图3）。3 种重楼提取物抗DPPH 自由基清除活性都比抗坏血酸强（IC50为6.432 mg/L）。

图3 重楼提取物及抗坏血酸的DPPH 清除活性

3 讨论

重楼皂苷Ⅱ具有重要的药理活性，现代药理学研究表明，重楼皂苷Ⅱ可减少细胞内活性氧产生和提高SOD 活性，从而对高糖干预下的GMC 增殖有一定抑制作用，并可减轻细胞氧化应激损伤［17］。重楼皂苷Ⅱ可联合CPT 作用于H446 细胞，作为CPT 的增敏剂用于肺癌方面的治疗［18］。目前，用于重楼皂苷检测的技术主要有超高效液相串联四极杆飞行时间质谱法（UPLC-QTOF-MS/MS）［19］、高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）［20，21］、分光光度法等，但是UPLC-QTOF-MS/MS 检测法需要较高的测试成本，HPLC-ELSD 与分光光度法存在重复性、准确性差等问题。

通过DPPH 清除试验发现，3 种重楼提取物都有一定的抗氧化功能，且七叶一枝花提取物DPPH 自由基清除活性最强。运用GC 技术对于恩施地区七叶一枝花、启良重楼、黑籽重楼中重楼皂苷Ⅱ成分的含量进行检测分析，发现该方法精密度高、操作简单，可用于重楼样品大规模分析检测；发现七叶一枝花中重楼皂苷Ⅱ的含量为0.104 mg/g，黑籽重楼中重楼皂苷Ⅱ的含量为0.098 mg/g，可以为开发黑籽重楼替代七叶一枝花药材、缓解重楼资源危机提供参考。