不明原因复发性流产蜕膜组织中血管内皮生长因子和雌孕激素受体的表达意义

温勤坚 (深圳市宝安区中心医院，广东 深圳 518102)

复发性流产通常指的是连续自然流产次数≥3次的一种综合征，其发病机制复杂，常与生殖系统解剖畸形、内分泌紊乱以及染色体异常等有关，还有一半患者无法查出病因，又被称之为不明原因复发性流产(URSA)。近年来有文献[1]报道，URSA的发生可能与孕激素受体(PR)和雌激素受体(ER)的表达异常有关，其中孕激素通过与PR的作用可以维持正常妊娠，而雌激素与ER相互作用能够维持靶组织的生长和发育过程，若蜕膜组织中的PR和ER数量减少，则会对激素的生理功能产生直接影响。而血管内皮生长因子(VEGF)作为调节体内血管的一个中枢物质，对血管内皮细胞具有一定的特异性，不仅可以对滋养细胞的迁移和分裂起到促进作用，有助于形成新生血管，而血管生成是早期着床、胎盘形成以及妊娠成功所必需的。有研究[2]发现，与正常妊娠者相比，难免流产和习惯性流产患者的胎盘滋养细胞VEGF表达明显较低。因此，本研究对URSA患者蜕膜组织中血管内皮生长因子和雌孕激素受体的表达意义进行了探讨。

1 资料与方法

1.1一般资料：选择我院收治的30例不明原因复发性流产孕妇为观察组，再选择同期的30例正常早孕人工流产孕妇为对照组，本研究经过本院医学伦理委员会同意。对照组停经35～70 d，平均停经(52.4±9.3)d；年龄21～39岁，平均(29.5±8.5)岁。观察组停经36～71 d，平均停经(52.5±9.4)d；年龄22～40岁，平均(29.7±8.6)岁。两组的停经天数和年龄等资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。入选标准：①临床资料完善，已明确临床诊断；②平素月经正常，既往无甲状腺功能异常及糖尿病病史；③无生殖器解剖学畸形；④流产绒毛行染色体核型分析未见异常；⑤无静脉血栓史和肝肾疾病；⑥3个月内无激素补充治疗病史。排除标准：①合并子宫肌瘤、多囊卵巢综合征或子宫内膜异位症者；②临床资料缺失者；③中途退出研究者；④严重意识障碍或精神异常者。

1.2方法

1.2.1仪器：选择奥林巴斯BX41显微镜、MICROM HMS760X染色机、塑料耐高温染色架和染色缸、DHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱、MICROM HM340E切片机以及石蜡急埋机。

1.2.2绒毛采集及检测：两组患者孕周相似，绒毛取自吸宫术时，在无菌生理盐水中保存吸出的绒毛，在实验室由专人对绒毛进行挑选，运用直接低渗的方法对染色体进行制备：G显带染色体，在显微镜下对10～20个分裂相细胞进行计数，对2～3个细胞核型进行分析，将胚胎染色体异常排除后，可测定蜕膜组织的激素受体。

1.2.3测定受体：人流术中同时无菌收集蜕膜2份，一份标本运用10%甲醛进行18～24 h固定后，常规石蜡包埋切片；另一份保存于-80℃冰箱中，将胚胎染色体异常排除后，测定蜕膜组织激素受体。同时，运用免疫组织化学方法对ER、PR的蛋白水平表达进行检测，并且对VEGF水平进行检测；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测蜕膜组织中ER及PR的表达。

1.2.4RT-PCR检测：0.9%生理盐水将蜕膜组织冲洗干净后，碾磨液氮至粉末后经过系列处理步骤使RNA提取步骤完成，并且去基因组、检测纯度、逆转录合成cDNA以及cDNA为模板进行PCR扩增。引物序列：ER(111 bp)：5'-GTCTGCCAGGTTGGTCAGTAAGC-3',PR(144 bp)：5'-GACCCTTTGCCTTCAGCT-CAGTC-3'。同时，扩增条件为：95 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，共40个循环，并且运用2-△△Ct对目的基因相对含量(RQ)进行计算，即2-△△Ct=RQ。

1.3观察指标：运用Sinierope改良判断法，将染色细胞百分比和染色强度乘积得分作为基本依据，对受体表达情况进行分级，其中>5分为强阳性(+++)；4～5分为中度阳性(++)；2～3分为阳性(+)[3]。

2 结果

2.1两组患者的VEGF水平比较：观察组的+++和++所占比例低于对照组，且+所占比例高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组VEGF水平对比[n(%)，n=30]

2.2两组免疫组化法检测PR和ER的表达比较：与对照组比较，观察组的ER表达阳性率低，组间对比差异有统计学意义(P<0.05)，两组的PR表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组免疫组化检测PR和ER比较(n，n=30)

2.3两组RT-PCR方法检测的PR和ER水平比较：观察组的ER表达明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，但是两组的PR表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 两组ER和PR水平比较

3 讨论

通常情况下，雌孕激素水平维持正常能够对子宫内膜容受性起到一定的促进作用，有助于植入胚泡和胎盘的形成发育，使胚胎处于正常生长发育状态，尤其是子宫蜕膜上的PR和ER在维持妊娠中发挥着极其重要的作用[4-6]。在受精卵着床中，雌孕激素之间存在着密切的联系，生理状态下，雌激素启动子宫内膜增值，诱导PR的产生，上调ER和PR。只有雌激素与相应的ER结合后，激素信号才可以向一系列细胞内的化学反应转化，PR和孕激素的生理效应才可以得到充分发挥，所以ER表达差异也会对妊娠结局产生直接影响[7-8]。在本次研究中，经免疫组化和RT-PCR检测，发现对照组的ER阳性率高于观察组(P<0.05)，但两组的PR阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明子宫蜕膜组织缺乏雌激素受体表达是导致URSA的一个重要原因。有文献报道[9]，将黄体功能不足诱发的流产排除后，若只给予患者单一孕激素补充，而雌激素水平不高的话，其保胎效果较差。因为雌激素水平低下胎盘组织作为雌激素的一个靶器官，其无法维持妊娠正常状态，并且雌激素水平低下会抑制蜕膜组织中的PR生成，使孕激素表达的生理效应得不到有效发挥，从而诱发诸多不良事件如营养差、蜕膜发育不良、流产或者胚胎死亡等[10-11]。有学者在研究中发现，蜕膜组织中的雌激素受体含量低，则子宫内膜对激素的反应性就会下降，也就降低了子宫内膜对胚胎的接受性[12]。而升高雌激素和孕激素受体水平，则能使Th1/Th2型细胞因子保持平衡，从而维持正常妊娠[13]。反之，减弱其表达后会对细胞因子网络产生破坏，使Th1和细胞因子偏离，对胚胎细胞的生长发育进行阻碍，从而诱发URSA[14]。

本次研究结果显示，观察组VEGF的+++和++所占比例低于对照组，且+所占比例高于对照组(P<0.05)。可以推断，VEGF在妊娠中起到一定的调节作用，VEGF表达不足，降低促血管内皮细胞迁移和增殖的能力，使与血管通透性相关的物质表达下调，绒毛血管生成出现缺陷，影响胎儿组织供血，诱发胎儿发育不良，从而导致早期自然流产[15]。

在本次研究中，观察组的ER和VEGF水平均低于对照组。有文献报道，ER对于妊娠维持有着十分重要的作用，雌激素通过与雌激素受体结合而导致目的基因表达，并且在多种组织中发挥其生理作用。有研究发现，在绒毛和蜕膜组织中均有ER表达，并且ER表达主要位于滋养细胞和蜕膜细胞胞核中，与本次研究报道一致。从本试验中可以假设，蜕膜组织中的VEGF减少，可能导致ER的表达不足，使蜕膜血管形成障碍，蜕膜无法正常发育而导致着床失败；若发生于胚胎着床后，则会阻碍胚胎血供，从而导致胚胎死亡或流产，ER和VEGF可能存在相互调节的机制，为后续进一步的研究及治疗提供了一个切入点。

综上所述，雌激素受体表达偏低可能是不明原因复发性流产的原因之一，ER水平低使子宫内膜对激素的反应性降低，导致子宫内膜发育不良，对胚胎的容受性降低，故ER异常直接影响到激素作用的结果。可考虑在不明原因复发性流产患者的早期阶段补充孕激素的同时，结合适量的戊酸雌二醇治疗，可能提高ER及VEGF的表达，为胚胎提供好的子宫内膜环境，而改善临床治疗效果。此实验结果，给临床上单用孕激素治疗效果不佳的患者在诊疗上提供了一个新的思路，具有重要的临床研究意义。