木犀草素促进鼻咽癌细胞凋亡和自噬的机制

王海茹，曹 卉，谭湘敏，龙 绮 (.海口市人民医院 中南大学湘雅医学院附属海口医院耳鼻咽喉头颈外科，海南 海口 57008；.海口市人民医院 中南大学湘雅医学院附属海口医院中心实验室，海南 海口 57008)

鼻咽癌(NPC)是起源于鼻咽部上皮细胞的恶性肿瘤[1]，常见于东南亚国家，在我国通常集中发生在南方，尤其是广东、广西等地。由于鼻咽癌放化疗不良反应大、生物治疗费用昂贵，因此对鼻咽癌发病的分子机制进行研究，寻找疗效好且不良反应小的抗鼻咽癌药物是临床上亟待解决的问题。自噬，又称Ⅱ型程序性细胞死亡，是细胞内降解细胞器的唯一途径，与肿瘤发生、发展，肿瘤的转移和能量代谢等过程有关[2]。研究鼻咽癌细胞凋亡、自噬及其信号通路有助于深入了解鼻咽癌的分子机制，为鼻咽癌治疗提供新方法。

木犀草素是一种天然黄酮类化合物，存在于多种药用植物中，如锦葵科、菊科、唇形科、马鞭草科、伞形科等。木犀草素可在多靶点、多途径、多环节产生抗肿瘤作用[3-4]。研究表明，木犀草素可以诱导自噬、抑制肿瘤细胞增殖[3-4]，但木犀草素是否对鼻咽癌细胞自噬有影响未知。因此本研究用木犀草素处理鼻咽癌细胞，观察其对细胞增殖凋亡的影响以及能否引起自噬，从而探讨木犀草素对鼻咽癌的作用机制。

1 资料与方法

1.1材料来源：本次研究经过本院医学伦理委员会同意。人鼻咽癌CNE-1细胞(来自广州塞库生物技术有限公司)在RPMI-1640培养基中培养(含10%胎牛血清)，并置于37℃和5%二氧化碳的恒温细胞培养箱中。木犀草素(货号: 491-70-3) 购自德思特生物技术有限公司，胎牛血清、RPMI-1640培养基、青链霉素购自美国Hyclone公司，四氮唑蓝盐化合物(MTS)、缺口末端标记法(TUNEL)试剂盒购自美国Promega公司，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自keygen公司，凋亡抑制蛋白(Bcl-2)、微管相关蛋白轻链3蛋白(LC3B)、泛素结合蛋白(p62)、自噬效应蛋白(Beclin-1)、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、蛋白激酶(AKT)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体购自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1MTS法检测细胞增殖:将对数生长期的人鼻咽癌CNE-1细胞按 1×104个/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后，加入不同浓度的木犀草素(0、20、40、60、80、100 μmol/L)，其中0 μmol/L组[未加木犀草素，只加等体积的二甲基亚砜(DMSO)稀释液]作为对照组，每个组设 3个复孔，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。收集培养后各个时间点的细胞(0 h、24 h、48 h、72 h)，加入1/10检测试剂(即100 μl培养液加入10 μl检测液)孵育4 h后，再用酶标仪检测仪读取OD490数值。实验重复3次，计算细胞增殖率。细胞增殖率=(其他时间点OD值均值÷0 h OD值均值-1)×100%。

1.2.2流式细胞检测细胞凋亡：CNE-1细胞接种于6孔板，细胞密度为1.5×104/well，接种后继续培养于37℃、5% CO2的培养箱中24 h，待细胞贴壁后，按照加入的木犀草素浓度(20、40、60、80、100 μmol/L)分为五组，对照组为加入等量培养基的细胞，各组都设3个复孔。培养48 h后弃去原培养基，0.25%胰蛋白酶消化后将细胞重悬于培养基中(密度约1×106细胞/ml)，转移含5×105个细胞的细胞悬液于离心管中，加入1.25 μl Annexin V-FITC和10 μl PI 染色液双染，用流式细胞仪检测CEN-1细胞凋亡率。

1.2.3透射电镜观察细胞内自噬体:将1×106个CNE-1细胞接种到10 cm平皿中培养，培养24 h后加入药物，加入药物48 h后，细胞培养24 h，加入不同浓度木犀草素(20、40、60、80、100 μmol/L)48 h，同时设立对照组，胰酶消化细胞，离心，重复离心两次后弃上清。2.5%戊二醛固定4℃2 h以上，1%锇酸固定2 h，依次加入梯度乙醇脱水，丙酮固定，包埋固化和切片后，枸橼酸铅染色，用透射电镜观察后拍照。

1.2.4Western印迹检测蛋白表达水平:将CNE-1细胞按1×106个细胞接种至培养瓶中，放入培养箱中培养24 h，开始加入药物，CNE-1细胞经不同浓度(20、40、60、80、100 μmol/L)木犀草素处理24 h后胰酶消化细胞，离心5 min后弃上清， 用PBS重悬细胞，继续离心2次后弃上清，加入提取缓冲液后4℃轻摇15 min。收集裂解液到EP管中，14 000 r/min离心15 min。取上清到新的EP管中。二奎啉甲酸(BCA)法测量蛋白浓度，电转移后转膜，脱脂奶粉封闭后分别加入一抗和二抗，增强化学发光法(ECL)显影。采用图像处理软件(Image J)检测膜上的蛋白表达条带，采用Prism 6.0用于统计各蛋白条带的OD值。检测指标有Beclin-1、LC3、PI3K、p-AKT和p-mTOR。

2 结果

2.1木犀草素抑制鼻咽癌细胞CNE-1增殖:利用不同浓度的木犀草素分别处理 CNE-1 细胞24 h、48 h、72 h 后，MTS结果显示，与对照组(0 μmol/L组)相比，木犀草素能够抑制CNE-1细胞的增殖，差异有统计学意义(P<0.05)，并且随着浓度和时间的增加，抑制增殖的作用增强。见图1。

图1 木犀草素抑制 CNE-1细胞增殖的作用

2.2木犀草素促进CNE-1细胞凋亡:流式细胞仪结果显示，与对照组相比，不同浓度(20、40、60、80、100 μmol/L)木犀草素处理的CNE-1细胞凋亡率显著提高，差异有统计学意义(P<0.05 或P<0.01)。见图2。

注：与0 μmol/L组比较：*P<0.05，**P<0.01图2 木犀草素对CNE-1细胞凋亡的影响

2.3透射电镜观察自噬体情况:不同浓度的木犀草素处理组细胞内均出现自噬体，随着药物浓度的增加，细胞自噬小体显著增多。见图3。

图3 木犀草素诱导CNE-1细胞形成自噬体(×5 000)

2.4Western印迹检测蛋白质表达：Western印迹分析结果显示，不同浓度的木犀草素随着浓度增加，凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下降(P<0.05)，自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著升高，p62蛋白表达降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4。木犀草素组p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的蛋白表达比对照组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图4 木犀草素对凋亡及自噬相关蛋白的影响

图5 木犀草素对P13K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达的影响

3 讨论

鼻咽癌是我国耳鼻咽喉恶性肿瘤的主要癌种和病死因素[5]。放化疗是目前主要的治疗方法，但晚期低分化鼻咽癌患者对放疗的敏感性较低，容易出现复发和转移[6]。因此发现更加有效的药物辅助鼻咽癌的治疗是亟待解决的问题。木犀草素是由木犀草中分离出而得名，化学名为3，4，5，7-四羟基黄酮。目前对于木犀草素的研究主要集中在抑制肿瘤细胞增殖、阻滞细胞周期、促进细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成方面[7-11]。为了探索木犀草素在治疗鼻咽癌中的作用，本研究选择人鼻咽癌CNE-1细胞作为研究对象，采用MTS法检测木犀草素对CNE-1细胞增殖的影响，随着木犀草素浓度的增加，CNE-1细胞的增殖能力显著降低，提示木犀草素对细胞的增殖具有抑制作用。细胞凋亡和自噬是程序性细胞死亡的两种死亡方式，可以共同作用于肿瘤细胞，促进肿瘤细胞死亡。

自噬，也称为Ⅱ型程序性细胞死亡，广泛存在于真核细胞中。 自噬通过将细胞质蛋白或细胞器包裹在单层或双层中形成自噬体，然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体。 最后，封装的内容物被降解，实现自我消化和细胞器更新[12]。自噬在介导肿瘤发展中起双刃作用，一方面诱导细胞自噬死亡，抑制肿瘤的发生，另一方面可能对肿瘤细胞的增殖有保护促进作用，自噬对肿瘤的作用与各种细胞类型和特定的肿瘤发展阶段有关。目前对自噬的研究中，Beclin1、LC3、和p62是比较公认的自噬标记蛋白。Beclin1是自噬的启动基因，它有增强自噬的作用[20]。LC3在形成自噬小体过程中起到锚定作用，指导溶酶体包裹，是评价自噬发生水平的重要指标，包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，LC3-Ⅰ是LC3的非活化形式。当自噬被激活时，LC3-I会将一个小肽水解成 LC3-II 并聚集在自噬体膜上[13]。因此，LC3-Ⅱ水平某种程度上反映了自噬的程度，是细胞内自噬的特异性蛋白标志[14]。p62是自噬吞噬过程中的转运蛋白，与LC3结合，运输被溶酶体包裏的细胞器，p62的表达水平和自噬呈负相关。本研究用流式细胞检测木犀草素处理前后的鼻咽癌细胞凋亡率，发现木犀草素可诱导CNE-1细胞凋亡,并且凋亡率和木犀草浓度的增加相关。Western印迹结果显示，Bcl-2蛋白表达下降，提示诱导细胞凋亡是木犀草素抑制鼻咽癌生长的重要机制之一。用不同浓度的木犀草素处理鼻咽癌细胞后，发现随着药物浓度的升高，被处理细胞自噬小体增加，同时蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著升高，Beclin-1升高，p62下降，这表明木犀草素除了除了明显抑制CNE-1细胞的活力外，还可促进LC3的表型转变，提示木犀草素可诱导CNE-1细胞发生自噬。细胞凋亡与自噬之间的关系是复杂的，其互补作用最为普遍且被广泛认可。在肿瘤细胞中，自噬受多种信号通路的调控[15]，其中磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)通路是最经典的一条。PI3K/Akt/mTOR信号通路由 PI3K、Akt 和mTOR三种蛋白酶构成，PI3K/Akt/mTOR信号通路轴通过促进细胞增殖和阻碍凋亡在NPC的进展中发挥重要作用[16]。此前有报道称它与细胞功能如增殖、迁移和转移有关。此外，越来越多的证据表明Akt/ mTOR级联控制自噬，自噬可以定义呼叫的存活和坏死，并在肿瘤发生中发挥关键作用，激活Akt可通过调节mTOR信号通路阻碍自噬。本研究结果表明，木犀草素明显阻断了CNE-1细胞中的 PI3K/Akt/mTOR 信号转导通路，通过刺激CNE-1细胞中的凋亡和(或)自噬抑制肿瘤细胞生长。