P2X2嘌呤受体缺乏对糖尿病视网膜病变的保护作用

李 晶，曾 玉，黄佳斯，程 翔，王刚强，黄德斌

(1.长沙市第三医院a.检验科；b.内分泌科,长沙 410015；2.空军军医大学西京医院检验科,西安 710000)

糖尿病视网膜病(DR)被认为是获得性视力障碍的最常见原因，占所有严重视力障碍病例的1.9%和所有失明病例的2.6%[1]。在血管改变之前，DR的临床特征包括免疫细胞的数量增加，产生活性氧和视网膜神经节细胞(RGC)死亡；这些特征与视神经中巨噬细胞/小胶质细胞和星形胶质细胞的激活有关，导致髓鞘紊乱和神经纤维数量减少[2]。P2X2嘌呤受体是阳离子选择通道，在中枢神经系统和周围神经系统广泛表达，并在不同过程中起重要作用，包括肌肉收缩、心血管和呼吸系统调节以及递质释放[3]。最近的研究[3-5]证实P2X2嘌呤受体在视网膜疾病中的作用，包括视网膜脱离、增生性玻璃体视网膜病变和DR。嘌呤受体参与慢性炎症，并且在糖尿病并发症中也观察到它们的上调[6]。然而，目前对于P2X2嘌呤受体在DR炎症机制中的作用知之甚少。因此，本研究探讨缺乏P2X2嘌呤受体对糖尿病小鼠视网膜形态学和视神经炎症的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

30只野生型(WT)和30只P2X2基因敲除(P2X2-/-)C57/Bl6小鼠(雄性，8周龄)购自北京大学实验动物中心。在整个实验过程中，将所有小鼠饲养在无特定病原体、12 h明暗循环的环境中，随意进食和饮水。按随机数字表法将小鼠分为正常WT组、正常P2X2-/-组、糖尿病WT组和糖尿病P2X2-/-组，每组各15只。

1.2 糖尿病诱导

糖尿病WT组和糖尿病P2X2-/-组建立糖尿病模型：通过单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma Aldrich公司，160 mg·kg-1体重)诱发。分别在血糖诱导前、STZ注射后1和8周，使用无糖Optium Neo(美国Abbott公司)评估血糖。血糖>16.7 mmol·L-1的动物被视为糖尿病。正常WT组、正常P2X2-/-组未接受STZ注射。分别在诱导糖尿病当天、STZ注射后1和8周对每只动物称重。

1.3 定量RT-PCR检测视网膜P2X2 mRNA

分别在血糖诱导前、STZ注射后1和8周处死小鼠，解剖眼睛。将分离的视网膜浸入RNAlater稳定剂(美国QIAGEN公司)中。使用QuantiTect Rev转录试剂盒(美国QIAGEN公司)将RNA与随机六聚体引物合成的第一链cDNA用作每个反应的模板。使用MX3000p装置(美国Stratagene公司)和SYBR Green Master mix(QIAGEN)进行实时定量PCR。为了标准化和定量，同时扩增小鼠18S mRNA。PCR条件如下：95 ℃持续15 min，然后在94 ℃持续15 s，60 ℃持续30 s和72 ℃持续30 s，进行46个循环。使用常规2-△△Ct方法计算目的基因的表达变化。每个样品一式两份运行，以确保单个值的可靠性。引物采用Vector NTI软件设计，并由上海生工生物工程股份有限公司合成：P2X2，Forward 5′-GCAGCGCTTAAC CATAGCGGAAAT-3′，Reverse 5′-CCAGTTGAAACGGTTCCCGATG-TT-3′；18S，Forward 5′-T CAACTTTCGATGGTAGTCGCCGT-3′，Reverse 5′-TCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCT-3′。

1.4 组织学检查和免疫组织化学分析

在STZ注射后8周，处死小鼠，取下眼睛，在4%多聚甲醛(美国Sigma Aldrich公司)中固定48 h。然后将其依次浸入5.0%、7.5%、10.0%和20.0%的葡萄糖溶液中，再用树脂包埋。取10 μm切片并固定在经多聚-L-赖氨酸包被载玻片上，分别进行组织学检查和免疫组织化学分析。组织学检查用苏木精和伊红(HE)染色，将染色部分通过分级的醇脱水，在二甲苯中澄清，并用中性脂覆盖。用光学显微镜(德国Zeiss Axioplan公司)检查切片。免疫组织化学分析方法：先用1 μg·μL-1生物素化山羊抗鼠IgG孵育切片20 min，然后在亲和素-生物素-过氧化物酶复合物工作液孵育30 min，最后在3,3′-二氨基联苯胺(DAB)溶液中孵育5 min。用P2X2抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司)分析P2X2免疫反应性。

1.5 视网膜神经节细胞计数

用兔多克隆抗βⅢ微管蛋白(1:500；美国Abcam公司)免疫染色视网膜评估正常和糖尿病WT和P2X2-/-小鼠的RGC存活率。在神经节细胞层(GCL)内，βⅢ微管蛋白仅在RGC中表达。在荧光照射(400×)下计数8个区域中的免疫阳性细胞，以量化每平方毫米RGC存活率。

1.6 视神经免疫荧光分析

切片在0.1 mol·L-1PBS中洗涤3次，在室温下封闭(含0.3%Triton X-100和10%驴血清的PBS)1 h，然后与兔多克隆抗IBA1抗体(1:250，美国Santa Cruz公司)孵育过夜。次日，切片与Alexa-Fluor 488山羊抗鼠次级抗体(1:500，美国Molecular Probes公司)孵育2 h，用DAPI(美国Molecular Probes公司)复染5 min。在激光扫描显微镜(LSM 510 META，德国Zeiss公司)上对染色进行分析和记录。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 糖尿病小鼠的血糖水平和体重变化

糖尿病诱导前2组小鼠的血糖水平均≤16.7 mmol·L-1，STZ注射后1和8周，糖尿病WT组和糖尿病P2X2-/-组小鼠的非空腹血糖水平均明显升高且>16.7 mmol·L-1(P<0.001)。与诱导前比较，STZ注射后8周糖尿病WT组小鼠的体重显著降低(P<0.01)，而糖尿病P2X2-/-组小鼠的体重比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 糖尿病小鼠的血糖和体重变化

2.2 WT小鼠DR过程中P2X2水平变化

免疫组织化学方法分析WT小鼠DR过程中P2X2在视网膜的分布显示，P2X2主要位于视网膜GCL、内核层(INL)和外核层(ONL)；与诱导前相比，糖尿病WT组在STZ注射后8周时视网膜中P2X2表达变得强烈(图1)。qRT-PCR定量分析显示，正常WT组小鼠在各观察时点视网膜中P2X2 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)，而糖尿病WT组小鼠在STZ注射后1、8周视网膜中P2X2 mRNA表达显著高于诱导前和正常WT组(P<0.001)(表2)。

表2 qRT-PCR定量分析WT小鼠DR期间视网膜中P2X2 mRNA的水平变化

A：诱导前；B：STZ注射后8周。比例尺=75 μm。

2.3 P2X2缺乏对糖尿病视网膜的形态学影响

通过HE评估WT和P2X2-/-小鼠视网膜形态见图2，对视网膜GCL的定性观察显示，与糖尿病WT组相比，糖尿病P2X2-/-组小鼠的RGC更多。形态学测量分析结果见表3：糖尿病WT组与糖尿病P2X2-/-组小鼠的视网膜总厚度及外丛状层(OPL)、ONL、内丛状层(IPL)、INL的厚度差异无统计学意义(P>0.05)。

A：糖尿病WT组；B：糖尿病P2X2-/-组。比例尺=50 μm。

表3 P2X2缺乏对小鼠糖尿病视网膜形态变化的影响

2.4 P2X2缺乏对糖尿病视网膜RGC的保护作用

用兔多克隆抗βⅢ微管蛋白对全视网膜进行免疫染色，结果显示，糖尿病显著降低了WT小鼠视网膜中RGC的总数(P<0.05)，但不影响P2X2-/-小鼠视网膜中RGC的总数(图3)。

A—D：正常WT组(A)、正常P2X2-/-组(B)和糖尿病WT组(C)、糖尿病P2X2-/-组(D)小鼠视网膜的βⅢ微管蛋白免疫染色；E：定量分析各组视网膜中RGC密度。比例尺=20 μm。*P<0.05与正常WT组相比；#P<0.05与糖尿病WT组相比。

2.5 P2X2缺乏对糖尿病视网膜炎症的影响

与P2X2-/-小鼠相比，糖尿病显著增加了WT小鼠视网膜中TLR4和IL-1β免疫反应性(P<0.05)，并且TLR4和IL-1β表达集中在GCL和神经纤维层(NFL)(图4)。

A—B:糖尿病WT组和糖尿病P2X2-/-组小鼠视网膜的TLR4蛋白免疫染色(A)及定量分析TLR4荧光强度(B)。C—D：糖尿病WT组、糖尿病P2X2-/-组小鼠视网膜的IL-1β蛋白免疫染色(C)及定量分析IL-1β荧光强度(D)。比例尺=20 μm。*P<0.05与糖尿病WT组相比。蓝色是hoechst33342染色。

2.6 P2X2缺乏对糖尿病小胶质细胞活化的影响

Iba1抗体染色检测视神经小胶质细胞含量结果显示，与糖尿病WT组小鼠相比，糖尿病P2X2-/-组小鼠视神经小胶质细胞明显减少(P<0.05)(图5)。

A：小鼠视神经Iba1染色的代表性显微照片；B：Iba1染色面积百分比定量分析。*P<0.05与糖尿病WT组相比。比例尺：50 μm。

3 讨论

P2X2嘌呤受体通过不同的免疫调节机制，分别减轻或增加周围神经系统和中枢神经系统中的神经炎症，从而影响神经系统损伤后神经结局[7-12]。然而，目前对于P2X2嘌呤受体在DR神经炎症机制中的作用知之甚少。本研究探讨缺乏P2X2对糖尿病小鼠视网膜形态学和视神经炎症的影响，结果显示糖尿病WT组与糖尿病P2X2-/-组小鼠的视网膜总厚度及OPL、ONL、IPL、INL的厚度差异无统计学意义(P>0.05)，但是糖尿病P2X2-/-组小鼠视网膜中显示出更多的RGC，以及TLR4、IL-1β表达减少(P<0.05)，表明嘌呤途径与DR神经炎症之间存在关联，但还需要进一步的实验验证。糖尿病是一种常见的视力损害原因。本研究发现与糖尿病WT组小鼠相比，糖尿病P2X2-/-组小鼠的视神经含有较少激活的小胶质细胞，这些细胞主要极化为抗炎表型。TLR4的免疫反应性增强可能与退化或脆弱的RGC有关。有研究[13]表明，糖尿病诱导TLR4介导的炎症小体激活，包括含有NLRP1和NLRP3的pyrin结构域，并激活视网膜中的IL-1β级联。此外，TLR4基因缺失或药物抑制显著降低DR的RGC死亡和促炎反应[14]。因此，笔者认为P2X2和TLR4信号的激活对炎症反应介导的DR中RGC变性至关重要。本研究在糖尿病P2X2-/-小鼠中观察到IL-1β蛋白表达显著减少也有力地支持了这一观点。

P2X2受体是阳离子选择性通道，对Na+和K+的通透性几乎相等，对Ca2+的通透性显著[15]。不同的功能研究[16]表明，P2X2受体存在于内皮细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞、胰腺细胞和垂体细胞中。P2X2嘌呤受体似乎可以促进创伤诱导的星形细胞凋亡，这种促进作用可以通过它们对ATP产生细胞外阳离子反应来实现[16]。此外，先前的研究[17]报道了一种通过抑制P2X2受体来促进神经元存活的新途径。本研究发现，糖尿病WT组小鼠在STZ注射后1、8周的视网膜中P2X2 mRNA表达显著高于诱导前水平。嘌呤受体可能以ATP依赖的方式调节细胞生长。糖尿病小鼠有更高的葡萄糖代谢，并增加ATP的生产。ATP还可能激活邻近视网膜神经元的P2受体，如光感受器、无长突细胞和神经节细胞[18]。另一方面，非糖尿病小鼠的P2X2表达较低。因此，笔者认为糖尿病WT小鼠在STZ注射后出现的这些变化会导致嘌呤信号增强。

DR是糖尿病患者严重的微血管并发症之一，越来越多的证据[19]表明，诸如氧化损伤和RGC死亡等神经变化可能先于血管损伤。本研究结果表明在糖尿病WT和P2X2-/-小鼠的视网膜组织中没有发现主要的组织学差异。然而，与糖尿病WT小鼠相比，糖尿病P2X2-/-小鼠视网膜中的RGC数量更高，与FERNANDEZ等[20]报道的结果一致：除了RGC会通过细胞凋亡而死亡，早期糖尿病不会引起视网膜改变。SZAB等[21]研究显示糖尿病会导致啮齿动物视网膜中发生离散变化，例如神经胶质反应性增加和小胶质细胞数量增加，以及泌乳细胞和外部感光细胞减少。这些离散的变化可能无法通过本研究以及其他研究[20]的视网膜形态学分析来识别。RGC凋亡可能是由于糖尿病视网膜中巨噬细胞/小胶质细胞活化增加和氧化应激所致[22]。P2X2参与神经炎症的作用已被其他研究者[3]提出。P2X2的上调抑制胶质细胞的激活，而选择性拮抗剂增强了星形胶质细胞的这种作用[16]。这些发现支持P2X2在神经炎性损伤中作用的观点。因此，研究P2X2缺失是否可以减弱视网膜炎症引起的RGC凋亡具有重要意义，进而将有助于延缓DR的发展。

总之，本研究结果证明了P2X2在糖尿病早期视网膜和视神经炎性损伤中的作用，表明P2X2可能是一个有吸引力的药物靶点。可为P2X2抑制剂治疗糖尿病视觉并发症的临床应用提供理论依据。