香叶木素对脓毒症所致小肠损伤大鼠模型的治疗作用

林传彬，毛春梅，李昌波

(内江市第二人民医院肛肠胃肠外科，四川 内江 641000)

脓毒症是感染、烧伤、创伤、休克等急危重病症的严重并发症[1]。肠道是脓毒血症发生及发展的重要始动及关键因素，脓毒症发生时可使肠黏膜上皮发生水肿，肠上皮细胞膜和细胞间连接发生断裂，细胞坏死，肠上皮细胞炎症反应过度激活，黏膜下血流灌注减少，引起肠道的通透性增加、肠道屏障功能损伤，肠道细菌和毒素被吸收进入循环系统从而引起细菌移位，使全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)加重、失控，严重时引发多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，并危及患者生命[2]。因此小肠损伤的治疗、保护成为脓毒症治疗中极为关键的环节。

核因子κB(NF-κB)是脓毒血症发生发展过程中的核心通路[3]，因此积极寻求抑制NF-κB通路的药物及治疗手段是减缓脓毒血症发展的关键。有研究[4-5]显示，多种中药可通过抑制NF-κB通路进而发挥其对脓毒症的治疗作用，对临床治疗具有重要的指导意义。香叶木素(Diosmetin，Dio)属于黄酮苷香叶木甙的糖苷配基，发现于金合欢树荚果和橄榄叶中，具有抗癌[6]、抗炎[7]、改善代谢[8]、保护心血管[9]等作用，但其在脓毒血症肠保护中的作用尚未得到验证。本研究旨在通过构造脓毒症所致小肠损伤大鼠模型，进而研究Dio对其的治疗保护作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 大鼠脓毒症模型的建立及分组

30只7周龄健康雄性成年SD大鼠购自东方生物服务公司(南京)。实验方案经伦理委员会批准，符合《实验动物护理与使用指南》(IACUC-190525-12)。所有大鼠维持12 h的光/暗循环，并随意喂食食物和水。实验前让大鼠适应环境1周。将大鼠随机分为对照组、模型组及治疗组，每组10只。脓毒症大鼠模型利用盲肠结扎穿刺法进行诱导：异氟醚麻醉下，正中切口1.5 cm暴露盲肠，随后在距盲肠尖端1 cm处用5-0丝线结扎，用18号针头穿刺盲肠，挤压出少量粪便，然后用无菌4-0丝线缝合切口。对照组大鼠行剖腹手术，不结扎、不穿孔。术后予液体复苏(皮下注射1 mL生理盐水)。对照组术后每日后腹腔注射生理盐水20 mg·kg-1，连续7 d；模型组术后每日后腹腔注射生理盐水20 mg·kg-1,连续7 d；治疗组术后每日腹腔注射Dio 20 mg·kg-1，连续7 d，Dio纯度≥ 95.7%，购自中国食品药品检定研究院。

1.2 小肠微血管灌注

大鼠麻醉后，沿腹中线进行剖腹手术并在Treitz韧带远端5 cm处确定空肠。利用激光多普勒灌注成像仪(瑞典Perimed aB公司)评估大鼠空肠黏膜血流，激光波长为670 nm；ldPi成像软件(版本2.5，瑞典Perimed aB公司)用于记录、分析和处理胃血流图像，单位：PU。

1.3 小肠组织的病理学观察

收集各组大鼠小肠组织，并在10%福尔马林中固定48 h。然后进行脱水、洗涤、石蜡包埋、切片及HE染色。在光学显微镜(日本Olympus公司)下观察形态学变化。

1.4 IL-1β、IL-6以及TNF-α检测

根据酶联免疫吸附剂测定(ELISA)试剂盒(美国Signosis公司，生产批号：20201024)说明书，对3组大鼠结肠组织上清液进行IL-1β、IL-6以及TNF-α测定，重复3次，取平均值。

1.5 Western blot法检测

利用RIPA裂解液对大鼠小肠组织全蛋白进行萃取。利用BCA法将各肠组织蛋白样品定量至相同浓度，取20 μg蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，湿转法将蛋白质转移至甲醇预活化的PVDF膜，以1：1000的稀释比例孵育抗体(ZO-1、Claudin-1及NF-κB p65)，4 ℃下过夜。次日，TBST洗涤后加入二抗，室温下孵育1 h，再次洗涤后，最后利用化学发光成像仪显影。

1.6 免疫荧光染色

各组大鼠小肠组织切片封闭后，先加入兔抗NF-κB p65抗体(上海碧云天生物技术有限公司，生产批号：20200906)后，4 ℃下孵育过夜，然后在室温下与二级山羊抗兔抗体孵育1 h，然后荧光显微镜(日本Olympus公司)下观察并采集图像。随后将组织和细胞与4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液(上海碧云天生物技术有限公司,生产批号：20200814)混合，在室温下反应5 min，然后在荧光显微镜(日本Olympus公司)下观察并采集图像。

1.7 统计学方法

使用SPSS21.0软件进行数据分析。计量资料表示为均数±标准差，多组之间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Dio治疗对脓毒症大鼠小肠组织病理学形态的影响

对照组的肠黏膜形态无明显变化，小肠绒毛排列整齐，黏膜上皮厚度无明显差异；模型组绒毛高度、宽度减少，绒毛断裂较多，且肠黏膜固有层出现单核细胞和浆细胞慢性炎性细胞浸润现象；而治疗组显示Dio能减轻脓毒症对小肠的损伤，使小肠形态得到明显改善。见图1。

图1 各组大鼠小肠组织的组织病理学表现(×100,HE染色)

2.2 Dio治疗对脓毒症大鼠空肠黏膜血流灌注的作用

与对照组相比，模型组大鼠空肠黏膜血流灌注明显减少(P<0.01)；而相较于模型组，治疗组大鼠空肠黏膜血流灌注显著增加(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠空肠黏膜血流灌注

2.3 Dio治疗对脓毒症大鼠小肠炎症反应的影响

与对照组相比，模型组大鼠小肠炎症因子均明显增加(P<0.001)，表明脓毒症大鼠小肠存在明显的炎症反应；而治疗组大鼠小肠组织中的炎症因子与模型组相比，均显著下降(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠小肠组织中IL-1β、IL-6以及TNF-α的水平

2.4 Dio治疗对NF-κB p65通路修复脓毒症诱导大鼠的紧密连接蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组大鼠小肠组织中ZO-1和Claudin-1表达水平显著下降(P<0.001)；与模型组比较，治疗组上述蛋白表达水平显著升高(P<0.001)。NF-κB p65在模型组中的表达水平显著升高(P<0.001)；治疗组该蛋白水平显著下降(P<0.01)。DAPI染色结果显示，模型组染色质固缩、形成很多颗粒物质、细胞核出现破裂形成碎片，核解体；治疗组中该现象得到明显的改善，其细胞核完整性提高。NF-κB p65染色结果发现，与对照组相比，模型组NF-κB p65数量明显增多，而治疗组NF-κB p65数量明显下降(P<0.001)。见表3、图2。

表3 各组大鼠小肠组织中ZO-1、Claudin-1及NF-κB p65的相对表达水平

A：Western blot检测；B:免疫荧光染色图像。

3 讨论

目前，脓毒症的临床治疗药物以抗生素及糖皮质激素为主，但是上述药物易出现耐药性及免疫抑制等风险，使临床治疗脓毒症的难度增加[10]。中医讲究论辨证论治，认为毒邪入侵、正气不足是脓毒症发病过程中的两个重要因素，因此在治疗时应合理使用活血化瘀、清热解毒、补益元气类中药[11]。本研究表明Dio对脓毒症所致的小肠损伤具有治疗作用，包括改善小肠的组织病理学形态及小肠黏膜下血流灌注。

Dio在多种疾病的治疗中具有抗炎作用，如在特应性皮炎中，Dio可减少皮肤病变中促炎性细胞因子(TNF-α，IL-4和IL-1β)的水平[12]；在内毒素诱导的大鼠急性肝衰竭过程中，Dio可发挥其抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用[13]。本研究结果显示，Dio治疗可减轻脓毒症所致小肠损伤大鼠小肠中炎症因子水平，小肠局部炎症反应减轻，提示在脓毒症所致的小肠损伤疾病中Dio可同样发挥其抗炎的作用，并且Dio可能通过降低小肠的炎症，对小肠损伤具有治疗保护作用。

ZO-1和Claudin-1同属紧密连接蛋白。Claudin-1在肠上皮中广泛表达，具有屏障形成功能，对紧密连接完整性具有重要作用[14]。ZO-1属于含有细胞质斑块结构域的蛋白质，有助于稳定具有肌动蛋白细胞骨架[15]。脓毒症发生时，会破坏小肠的屏障功能，紧密连接蛋白被破坏。本研究结果显示，脓毒症大鼠小肠组织中ZO-1和Claudin-1的表达降低，而Dio治疗促进了它们的表达。提示Dio可提高小肠细胞紧密连接和肠屏障功能，发挥其保护作用。在脓毒症的发病过程中，NF-κB 活化的主要诱导介质有细菌释放的脂多糖，热休克蛋白90和高迁移率组蛋白等[16]。本研究结果显示，Dio治疗后大鼠小肠组织中NF-κB p65显著下降，提示NF-κB可能是Dio在脓毒症诱导的小肠损伤中保护作用的机制之一。

综上所述，Dio通过抑制NF-κB对脓毒症小肠损伤具有治疗保护作用。因此，Dio可能是脓毒症诱导的小肠损伤的潜在治疗药物，但详细机制尚需进一步阐明。