急性盐度胁迫对美洲鲥幼鱼渗透调节的影响

2022-07-20戴习林

水产科学 2022年4期

郭印，戴习林

(1.上海农林职业技术学院，上海 201600； 2.上海海洋大学，水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306； 3.上海海洋大学，农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306；4.水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心，上海 201306)

美洲鲥(Alosasapidissima)又名美洲西鲱，与中国的鲥(Tenualosareevesii)同属鲥亚科，二者外部形态接近，美洲鲥具有较高的营养价值和经济价值[1]，市场价格较高，养殖面积日益扩大[2]。盐度是影响鱼类正常生理活动与分布的重要环境因子，对鱼类的生理生化、离子细胞大小和数量等指标有重要影响[3]。美洲鲥具有典型的溯河洄游特征[4]，对盐度的适应性相对较强，亲本培育中也常利用盐度升降处理模拟美洲鲥的洄游生境[5]，然而在盐度的急性胁迫下美洲鲥也会出现中毒症状[6]，掌握急性盐度变化下美洲鲥的渗透压调节方式，对人工养殖过程中控制适宜的盐度具有重要的意义[7]。近年来，众多学者研究了盐度变化对不同鱼类生理的影响以及鱼类对盐度的适应机制[8-16]，发现鱼类血液渗透压、Na+/K+-ATP酶活性、抗氧化酶活性等指标在研究鱼类盐度胁迫下渗透压调节机制和生理变化的过程中具有重要的意义，然而目前对急性盐度下美洲鲥的相关研究仍相对较少。笔者以幼鱼阶段的美洲鲥为研究对象，探讨不同盐度对美洲鲥幼鱼的血清渗透压、Na+/K+-ATP酶活性和过氧化氢酶活性的急性胁迫效应，以期为美洲鲥对盐度突变的适应性研究提供理论依据，并为生产中通过进行盐度调节从而调控美洲鲥的生长发育、提高存活率以及促进美洲鲥养殖产业的发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用美洲鲥幼鱼购自上海申漕特种水产养殖公司，体长(6.3±0.3) cm，体质量(3.3±0.5) g。按60尾/m3分别置于500 L圆形塑料桶淡水中进行暂养，塑料桶内事先铺设孔径550～700 μm筛绢网，便于后期转移试验鱼，使用散气石不间断充气。试验期间投喂浙江明辉牌海水鱼配合饲料(粒径1.8 mm，粗蛋白含量44%)，每日8：00和16：00各投喂1次，投饲率1%～2%，以1 h摄食完为准。暂养期间测得溶解氧7.63～7.89 mg/L，水温29.0～32.2 ℃，每日18：00虹吸去除试验桶底部杂质粪便。暂养15 d后，选取规格相近的健康个体进行试验。

1.2 试验方法

试验容器为500 L圆形塑料桶，试验用水由曝气24 h后的自来水与海盐按比例调配制成，试验前用盐度计(YSI30型)进行校准。有研究表明，美洲鲥仔鱼24 h全致死盐度(LC100)为30，96 h零致死盐度(LC0)为20[6]，故本试验设淡水为对照组，另设盐度5、10、20试验组，各组均设3个平行。每个平行投放试验鱼30尾，每组共计90尾。试验开始时，各组水温为(30±2) ℃、溶解氧为(7.5±0.3) mg/L、pH为7.6±0.4。用筛绢网将美洲鲥幼鱼自淡水中取出，直接放入各盐度组(含对照组)水体中。

试验期间停止投喂，在0、6、12、24、48、96 h分别从每组中随机挑取9尾(每个平行3尾)，使用10 mg/L丁香油麻醉，用1 cm3注射器心脏采血，每3尾鱼所取血液作为1个测定样本，混合后置于离心管分装后静置15 min，待血液分层后以 3500 r/min离心(离心半径10 cm)5 min，所得血清用于渗透压测定。抽血后快速将鱼右侧第二鳃弓上鳃丝取下，以4 ℃双蒸水冲洗3次，去除污物，每3尾鱼所取鳃丝混合作为1个样本，置于5 mL无菌离心管中，转移至超低温冰箱内保存用于测定Na+/K+-ATP酶活性。取鳃丝后立即进行解剖并挑取肝脏组织，3尾鱼肝脏混合后作为1个测定样本，清洗后置于超低温冰箱保存，用于过氧化氢酶活性的测定。

1.3 测定方法

1.3.1 血清渗透压的测定

美洲鲥幼鱼的血清渗透压使用冰点渗透压仪(Vapro5600型)测定，单位：1 mOsm/kg表示1 kg 溶剂中含1 mmol溶质。

1.3.2 鳃Na+/K+-ATP酶活性的测定

将鳃丝在匀浆介质(0.01 mol/L蔗糖，0.1 mmol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L Tris-HCl，0.8% NaCl，pH 7.4)中剪碎，使用匀浆器(PRO250型)15 000 r/min制成匀浆，4 ℃下2500 r/min低温离心(离心半径10 cm)5 min后取上清液[16]，Na+/K+-ATP酶活性的测定与计算按照南京建成生物工程研究所生产的Na+/K+-ATP酶试剂盒说明书操作。

1.3.3 肝脏过氧化氢酶活性的测定

准确称取肝脏组织质量，在匀浆介质(0.01 mol/L蔗糖，0.1 mmol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L Tris-HCl，0.8% NaCl，pH 7.4)中剪碎，使用匀浆器(PRO250型)15 000 r/min制成匀浆，4 ℃下3000 r/min低温离心(离心半径10 cm)5 min后取上清液[17]，按照南京建成生物工程研究所生产的过氧化氢酶试剂盒说明书进行测定。

1.4 数据处理

试验数据通过Excel 2019与SPSS 19.0统计软件进行处理和分析，数据以平均值±标准差表示。利用方差分析检验盐度对测定指标影响的显著性，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 急性盐度胁迫下美洲鲥幼鱼的渗透压变化

急性盐度胁迫下美洲鲥幼鱼血清渗透压的变化情况见图1。由图1可见，盐度处理对美洲鲥幼鱼血清渗透压有显著影响(P<0.05)。从盐度胁迫的时间过程来看，各盐度组渗透压随时间的延长呈现先快速升高后逐渐降低的趋势，其中盐度20试验组在6 h时达到最大值[(265.4±4.8) mOsm/kg]，而盐度5试验组、盐度10试验组在12 h时达到最大值[(262.3±2.8) mOsm/kg、(266.0±3.1) mOsm/kg]。24 h后盐度5、10、20试验组幼鱼血清渗透压随时间变化呈下降趋势并逐渐稳定。从各时间点比较4组不同盐度处理的渗透压变化，结果显示，处理6 h时各试验组幼鱼血清渗透压随盐度的升高均出现上升，12～96 h各时间点基本表现出盐度高的处理组其渗透压较高，且与对照组差异显著(P<0.05)。盐度5试验组美洲鲥幼鱼血清渗透压在6、48 h时显著低于盐度20试验组(P<0.05)。试验结果表明：提高盐度处理时，美洲鲥幼鱼可以通过升高自身的渗透压以适应外界的高盐度环境；美洲鲥幼鱼对盐度的胁迫反应较强烈，盐度差越大，其渗透压的应激反应越快并越强烈，随后会随着时间的延长而逐渐下降，或趋于稳定。

2.2 急性盐度胁迫下美洲鲥幼鱼Na+/K+-ATP酶活性变化

盐度处理对美洲鲥幼鱼Na+/K+-ATP酶活性影响显著(P<0.05)(图2)。从盐度胁迫的时间过程来看，6 h后各试验组Na+/K+-ATP酶活性显著下降，12～24 h各试验组Na+/K+-ATP酶活性总体趋于平缓，48 h各试验组Na+/K+-ATP酶活性总体呈上升趋势，96 h盐度5、10试验组继续上升，盐度20试验组出现下降。整个试验过程中试验组Na+/K+-ATP酶活性明显低于对照组(P<0.05)。从各时间点比较4个不同盐度处理的Na+/K+-ATP酶活性，结果显示，6 h时盐度10、20试验组显著低于盐度5试验组(P<0.05)，12～48 h各试验组无显著性差异，96 h时盐度20试验组显著低于其他2个试验组(P<0.05)。试验结果表明，美洲鲥对急性盐度的胁迫反应较强烈，Na+/K+-ATP酶活性出现了较大幅度下降，且盐度差越小，其Na+/K+-ATP酶活性出现上升趋势所用时间越短。

图1 急性盐度胁迫对美洲鲥幼鱼血清渗透压的影响Fig.1 Effect of acute salinity stress on serum osmotic pressure of juvenile American shad A. sapidissima相同时间不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)，下同.Means with different letters at the same time are significant difference among treatments (P<0.05)，et sequentia.

图2 急性盐度胁迫对美洲鲥幼鱼鳃丝Na+/K+-ATP酶活性的影响Fig.2 Effect of acute salinity stress on Na+/K+-ATP enzyme activity in gill filaments of juvenile American shad A. sapidissima

2.3 急性盐度胁迫下美洲鲥幼鱼过氧化氢酶活性变化

从盐度胁迫的时间过程来看：盐度5试验组美洲鲥幼鱼过氧化氢酶活性在6 h时升高，12～24 h维持相对稳定状态；盐度10试验组酶活性在6 h时未出现明显变化，12～24 h出现下降(图3)；两组至48 h均达到峰值，96 h出现下降；盐度20试验组幼鱼酶活性在试验期间持续下降。从各时间点看：6～12 h，盐度5试验组过氧化氢酶活性显著高于其他组(P<0.05)，盐度10试验组6 h时与对照组无显著差异，12 h时显著低于对照组(P<0.05)；24～48 h时各盐度组过氧化氢酶活性差异显著(P<0.05)，24 h时酶活性依次为对照组>盐度5试验组>盐度20试验组>盐度10试验组，48 h时酶活性大小为盐度5试验组>盐度10试验组>对照组>盐度20试验组，盐度20试验组显著低于其他组(P<0.05)；96 h时各试验组过氧化氢酶活性均显著低于对照组(P<0.05)，其中盐度5试验组显著高于盐度10、20试验组(P<0.05)。试验结果表明，急性盐度胁迫对美洲鲥幼鱼过氧化氢酶活性有较强的影响，表现为盐度变化越大该酶活性越易受到抑制。

3 讨论

3.1 急性盐度胁迫对美洲鲥幼鱼血清渗透压的影响

高盐度环境下幼鱼需消耗一定能量来维持体内渗透压，直接影响摄入营养的分配和饵料利用率，会对鱼类的生长产生影响[18-19]。鱼类渗透压调节主要通过肾脏、鳃等器官完成[20]，幼鱼由淡水进入高盐度环境，其血清渗透压低于水体渗透压，幼鱼会大量吞饮盐水同时摄入大量离子，这些离子通过肠道吸收进入血液，血清中离子浓度增高，渗透压也随之增高。在高渗环境中鱼类的渗透压调节主要通过大量饮水，鳃丝上的氯细胞排出大量的Na+，

图3 急性盐度胁迫对美洲鲥幼鱼过氧化氢酶活性的影响Fig.3 Effect of acute salinity stress on catalase activity of juvenile American shad A. sapidissima

肾脏排出部分离子与极少量的水分来维持体内的低渗透压[11,14]。鱼类对盐度的适应过程分两个阶段：一是盐度升高或降低后，短期内鱼类血清渗透压迅速变化的阶段；二是渗透压逐渐恢复稳定的阶段[21]。在本试验中，美洲鲥幼鱼的渗透调节在盐度5、10、20环境中明显升高，24 h前为幼鱼对盐度变化的适应阶段。有研究表明，硬骨鱼类血清渗透压会随盐度呈正相关的变化[11]。本试验中，各试验组美洲鲥幼鱼血清渗透压随盐度升高也相应升高，并出现波动变化，24 h后，各处理组美洲鲥幼鱼血清渗透压稳定在246.0～255.3 mOsm/kg，并随着时间推移缓慢降低。96 h时各盐度组血清渗透压均有恢复正常的趋势，与施兆鸿等[16]结论一致。说明美洲鲥幼鱼在一定范围内的盐度突变下，可以通过自身渗透压调节去适应环境变化，并表现为盐度差越大，其渗透压的应激反应越强烈，随后会随着时间的延长逐渐趋于稳定，对盐度有较强的适应能力。

3.2 急性盐度胁迫对美洲鲥幼鱼Na+/K+-ATP酶活性的影响

鳃是鱼类进行渗透调节和离子运输的主要器官，鳃上皮氯细胞中含有大量Na+/K+-ATP酶，该酶是鱼体氯细胞与外界离子转运的关键酶，也是广盐性鱼类参与渗透调节的一项重要指标[22]。Na+/K+-ATP酶在环境盐度发生变化时，鱼类鳃丝Na+/K+-ATP酶活性会升高或降低，这是鳃对体内外Na+和Cl-等离子运输需要的适应机制[23-25]。

广盐性鱼类的Na+/K+-ATP酶活性一般随盐度变化呈“U”型变化，在等渗点附近Na+/K+-ATP酶活性最低[9]。本试验结果表明，24 h内试验组美洲鲥幼鱼鳃丝Na+/K+-ATP酶活性均随盐度的升高而降低，在24 h时酶活性达到最低，盐度5试验组、盐度10试验组幼鱼鳃丝Na+/K+-ATP酶活性48、96 h持续上升，总体呈“U”型分布，并表现为盐度差越小，酶活性出现上升趋势所用时间越短。盐度20试验组幼鱼的Na+/K+-ATP酶活性在48 h上升，96 h下降，未呈现“U”型变化，说明盐度20的急性变化对幼鱼的渗透调节胁迫要大于低盐度环境[13]。由于鳃丝Na+/K+-ATP酶不是鱼类渗透压调节的唯一要素，故本试验中盐度20试验组酶活性上升受阻，可能与盐度胁迫下美洲鲥幼鱼需要时间去启动其他调节机制有关，具体机理待进一步研究。

3.3 急性盐度胁迫对美洲鲥幼鱼过氧化氢酶活性的影响

过氧化氢酶在鱼体清除胁迫过程中产生的活性氧自由基环节中起重要作用[19,26]，过氧化氢酶能防止代谢及超氧化物歧化酶转化过程中产生的过氧化氢对机体造成伤害，以抵御盐胁迫，防止生理应激[27]。当盐度发生变化时，鱼类必然要经历渗透调节等一系列过程[28]，需要消耗大量能量，加速体内新陈代谢，引发体内抗氧化酶的响应，以应对自由基对机体的胁迫。有学者研究发现，大菱鲆(Scophthalmusmaximus)幼鱼[29]、条石鲷(Oplegnathusfasciatus)幼鱼[30]、施氏鲟(Acipenserschrenckii)[12]在不同盐度胁迫下体内过氧化氢酶活性均会发生适应性变化，来消除盐度突变下产生的多余自由基以维持机体的正常功能。本试验中，盐度5试验组、盐度10试验组的过氧化氢酶活性变化趋势一致，其变化幅度与盐度有着密切的关系，表现为先升后降，说明急性盐度的胁迫对幼鱼酶活性有较强的影响，其中盐度5试验组过氧化氢酶活性响应时间较盐度10试验组快，表明美洲鲥较为适应盐度5的环境变化。盐度10试验组酶活性响应慢的原因可能为盐度胁迫导致美洲鲥幼体内产生并堆积较多活性氧自由基，过氧化氢酶活性需要一定时间诱导缓慢升高来减少自由基对细胞的伤害[31]，这与谭春明等[32]研究结果较为一致。有研究表明，鱼类在过高盐度胁迫下会生成大量活性氧，过量的活性氧在体内往往表现为毒性分子，易导致机体受氧化胁迫，引起细胞氧化损伤，从而破坏生理机能[33-35]。本试验中，盐度20试验组过氧化氢酶活性长时间显著低于对照组，盐度变化越大该酶活性越易受到抑制，可能在盐度20的急性胁迫下，幼鱼未能较好地适应环境，体内氧自由基不断积累，抗氧化酶的活性不足以抑制细胞内的氧化损伤，导致清除自由基的能力下降，从而使抗氧化酶活性降低[36]。