多数据库研究CRYAB在宫颈癌中的表达及相关机制

黄宏宝，吴小勤，卢东林，覃莉，韦敬锡，罗小琼，黄秋艳，陈发钦

(1. 右江民族医学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院附属医院生殖医学中心，广西 百色 533000；3. 右江民族医学院附属医院临床病理诊断与研究中心，广西 百色 533000；4. 右江民族医学院附属医院妇科，广西 百色 533000)

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，对女性的身心健康构成严重的威胁。国际癌症硏究中心(IARC)最新数据显示，宫颈癌在全球女性肿瘤的发病率和死亡率中仍然排名第四[1]。宫颈癌的病因目前不十分明确，公认的高危风险是高危型人类乳头状瘤病毒(HPV)感染，IARC将13种高危HPV亚型认定为Ⅰ类致癌物。近年来，宫颈癌筛查的广泛普及使宫颈癌的早期诊断率得到明显提升，但是中晚期或者复发的患者死亡率依然居高不下。以分子机制研究为基础的靶向治疗取得一定的进步，目前已有应用于临床的靶向药物，前景可观，但同样显现了其局限性，寻找高效的分子靶点对宫颈癌的研究意义重大。αB-晶状体蛋白(CRYAB)是一种蛋白质编码基因，染色体定位于11q23.1，长度约15 177 B，含6个外显子，和其他小分子热休克蛋白一样，它有一个保守的中心结构域，而位于两侧的N端结构域和C端结构域是高度可变的非保守序列，这些序列对于分子伴侣功能至关重要[2]。CRYAB分子伴侣功能可以防止因环境刺激导致的靶蛋白展开和聚集，并将易聚集的蛋白保存在其可溶性寡聚体结构中，避免蛋白质功能的丧失和有毒中间产物的生成[3]。CRYAB最初在人眼的晶状体中被发现，最新的Bgee Gene显示，它在心脏和243 种其他组织中表达。研究发现，CRYAB在鼻咽癌、膀胱癌、前列腺癌中表达下调[4-6]，而在乳腺癌、骨肉瘤等肿瘤中高表达[7-8]。目前CRYAB与宫颈癌的关系尚不明确，本研究利用生物信息学系统分析CRYAB在宫颈癌中的表达及相关机制，旨在为宫颈癌的分子研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 CRYAB在宫颈癌及泛癌中的表达 运用UALCAN网页工具(http://ualcan.path.uab.edu/)分析TCGA数据库宫颈癌组织样本中CRYAB的表达情况。UALCAN是美国阿拉巴马大学伯明翰分校的癌症数据分析门户网站，该网站是一个内容丰富且对用户友好的网络资源，用于分析各种癌症分开数据库(TCGA、MET500、CPTAC 和 CBTTC)中的组学数据[9]。利用临床生信之家(https://www.aclbi.com)网页工具分析GEO数据库宫颈癌组织样本中CRYAB的表达情况。该平台是国内学者搭建，原始数据来源自TCGA和GEO数据库，所有分析数据均由Rv4.0.3分析完成，用户可以在不使用R语言的情况下完成对数据的全方位分析，GEO数据库分析更是其亮点。通过网站上GEO模块中的基因表达比较选项来探索GEO数据库GSE46857组织样本中CRYAB的表达情况[10]。利用仙桃学术网站(https://www.xiantao.love)分析TCGA和GTEx数据库对比宫颈癌样本中CRYAB的表达情况。仙桃学术网的生信工具同样为用户提供了便捷的生信分析方式，将GTEx的数据纳入分析，提高结果的可靠性。

1.2 CRYAB的表达与宫颈癌生存期及临床病理特征的关系分析 通过GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析CRYAB与宫颈癌患者生存期的关系；该网站基于TCGA和GTEx数据为用户提供快速且可定制的分析功能[11]。UALCAN用来分析CRYAB与宫颈癌患者肿瘤分期、人种、体重、年龄、组织学类型和淋巴结转移的相关性。

1.3 免疫浸润分析 通过TIMER 2.0(http://timer.cistrome.org/)分析在宫颈癌组织中CRYAB表达量与免疫细胞浸润的相关性；TIMER 的最大特色是免费分析不同种类癌症的免疫浸润。2.0版本的网络服务器通过多种计算方法评估免疫细胞的浸润程度，而用户只需简单的操作即可得到高质量的图形，以此来全方位的探索肿瘤免疫学、基因组和临床特征[12-14]。

1.4 共表达基因分析 LinkedOmics数据源来自TCGA项目的 32 种癌症类型和总共11 158名患者的多组学数据和临床数据[15]。通过LinkedOmics(http://www.linkedomics.org)网站下载并分析CRYAB共表达的基因，将高表达前50和低表达前50的基因制作成热图。STRING (https://cn.string-db.org/)数据库从多个来源收集证据，目的是整合蛋白质之间所有已知和预测的关联，包括物理相互作用和功能关联[16]。利用STRING数据库制作蛋白互作图，寻找关键基因。

1.5 共表达基因富集分析 从LinkedOmics网站下载共表达基因信息，筛选出高表达前200和低表达前200的基因制作成列表，再用Metascape网站(https://metascape.org/)进行下一步研究，该网站可以为用户提供全面的基因列表注释和分析资源[17]，利用此功能对共表达基因进行GO和KEGG通过富集分析，寻找可能的作用机制。

2 结果

2.1 CRYAB基因在宫颈癌和癌旁组织或正常宫颈组织的表达比较 在TCGA中，CRYAB基因在宫颈癌组织中的表达水平低于癌旁组织，见图1A；在GEO数据库GSE46857数据集中，CRYAB基因在宫颈癌组织中的表达水平低于癌旁组织，见图1B；CRYAB在27种癌症中存在差异表达，差异有统计学意义，见图1C。

A：CRYAB在TCGA宫颈癌及癌旁样本中的表达情况；B：CRYAB在GEO宫颈癌及癌旁样本中的表达情况；C：CRYAB在TCGA和GTEx泛癌配对样本中的表达情况。

2.2 CRYAB的表达与宫颈癌生存期及临床病理特征的影响 GEPIA数据库分析结果显示，CRYAB的表达与宫颈癌患者的总体生存期无相关性(P=0.58)，见图2A，与患者的无病生存期无相关性(P=0.23)，见图2B。UALCAN数据库分析表明，从肿瘤分期来看，Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者的CRYAB表达低于癌旁组织，Ⅰ期患者CRYAB表达量与癌旁组织无差异，4个期别间的CRYAB表达量无差异，见图3A。从人种来看，白种人、非裔美国人和亚洲人宫颈癌患者CRYAB表达量低于癌旁组织，各人种之间的CRYAB表达无差异，见图3B。从体重来看，正常体重、超重、肥胖和过度肥胖患者CRYAB的表达量低于癌旁组织，但不同体重组之间表达量无差异，见图3C。从年龄层次来看，21～40岁组和61～80岁组患者CRYAB的表达量较癌旁组织明显偏低；41～60岁组较21～40岁组患者CRYAB的表达量偏高，而81～100岁患者的CRYAB表达量高于41～60岁组；其余各组的表达量无差异，见图3D。从组织学类型看，宫颈鳞状细胞癌、普通型宫颈管腺癌和宫颈内膜样腺癌组织中CRYAB的表达量低于癌旁组织；宫颈鳞状细胞癌组织中CRYAB的表达量明显高于宫颈腺鳞癌和普通型宫颈管腺癌；其余各组间表达无差异，见图3E。从淋巴转移的情况来看，N0期(无局部淋巴结转移)和N1期(有1～3枚腋窝淋巴结转移)组织中CRYAB表达量低于癌旁组织，但N0和N1两组间表达量无差异，见图3F。

A：CRYAB表达量与宫颈癌患者总体生存期相关性；B：CRYAB表达量与宫颈癌患者无病生存期相关性。

A：CRYAB与宫颈癌肿瘤分期的关系；B：CRYAB与宫颈癌患者人种的关系；C：CRYAB与宫颈癌患者体重的关系；D：CRYAB与宫颈癌患者年龄的关系；E：CRYAB与宫颈癌组织学类型的关系；F：CRYAB与宫颈癌患者淋巴结转移的关系。

2.3 CRYAB与宫颈癌免疫细胞浸润水平的相关性 TIMER 2.0分析显示，CRYAB在宫颈癌组织中与肿瘤细胞纯度无相关性，与造血干细胞、肿瘤相关成纤维细胞和内皮细胞呈显著正相关(P<0.01)，与单核巨噬细胞、NK细胞、CD8+ T细胞和B细胞呈负相关(P<0.05)。如图4所示。

图4 CRYAB表达与宫颈癌免疫细胞浸润水平相关性

2.4 宫颈癌组织中的CRYAB共表达基因分析 利用LinkedOmics网站，筛选出与CRYAB具有正或负相关性的前50个共表达基因，并以热图的形式展示，正相关的基因按P值升序排列，前5个为：NDRG4、IVL、KRT75、SBSN和FABP12，见图5A；负相关的基因按P值升序排列，前5个为：KIAA0649、TMPRSS3、GOLM1、ALDH3B1和RHOBTB2，见图5B。STRING蛋白互作分析显示，SPRR1B、IVL、SPRR1A、SPRR3和SPRR2A相关联，CRYAB与HSPB1和HSPB2相关联，见图5C。

A：宫颈癌中与CRYAB表达正相关的基因；B：宫颈癌中与CRYAB表达负相关的基因；C：共表达基因互作关系。

2.5 CRYAB及共表达基因GO注释和KEGG通路富集分析 为了预测与CRYAB共表达基因的功能，下载LinkedOmics网站上的共表达基因，选取上调和下调前200个基因合并成列表，利用Metascape网站进行GO注释和KEGG通路富集。结果显示，共表达基因参与表皮发育、包膜角化、多肽交叉连接、钙离子结合和中间纤维细胞骨架组织等，见图6A，通路富集在金黄色葡萄球菌感染、黏蛋白O-聚糖生物合成、核苷酸糖的生物合成、IL-17信号通路和癌症的通路等，见图6B。

A：共表达基因GO注释；B：共表达基因KEGG通路富集。

3 讨论

宫颈癌是一种女性常见的恶性肿瘤，好发于子宫颈鳞状、柱状上皮连接处的细胞。“高致癌性”人乳头瘤病毒(HPV)感染[18]和主要遗传因素[19](包括基因和染色体的改变、抑癌因子和激活因子水平的改变)是宫颈癌发生发展的关键。中国2020年宫颈癌的新发病例为109 741例，死亡病例为59 060例。与2015年相比，新发病率基本持平，但死亡率却明显增加(约从3.4万上升至5.9万)[20]。寻找宫颈癌筛查的生物标志物和治疗靶点意义重大。随着政府宫颈癌筛查项目和HPV疫苗的不断推广，宫颈癌在一定程度上是可以预防的。但在中国，因地域及经济和文化的差异仍然较大，一些地区女性接种HPV疫苗或意愿仍然不高[21]，某些地区女性宫颈癌健康素养较低[22]，提高老年女性、文化程度低、农村妇女等人群的宫颈癌预防知识仍然任务艰巨。哺乳动物的晶状体蛋白可分为α、β和γ家族；作为分子伴侣，尽管它们不会使蛋白质再生并释放它们作为真正的伴侣。但是，它们结合错误折叠的蛋白质以防止蛋白质聚集，除此之外，CRYAB还有另外两个特别的功能，自身激酶活性和参与细胞骨架的稳定[23]。CRYAB的这些功能可能与肿瘤的调控相关。

本研究显示，CRYAB在宫颈癌中呈低表达，这与前人在鼻咽癌、膀胱癌和前列腺癌中的研究一致，CRYAB在这些肿瘤中可能是一种抑癌基因，而在乳腺癌、骨肉瘤等肿瘤中可能是促癌作用。这显示了调控因子功能的多样性和复杂性。CRYAB表达与肿瘤分期、人种、年龄、体重、组织学类型和淋巴转移存在一定的相关性，但结果表明，各肿瘤分期组间、不同人种组间、不同体重组间和淋巴转移数目组间CRYAB的表达量无差异。从年龄来看，年龄更大的患者，CRYAB的表达量有升高的趋势，在不同组织类型的宫颈癌中，CRYAB的表达量存在一定差异，但无明显规律。本次研究结果还显示，CRYAB的差异表达诱导肿瘤微环境中免疫细胞的改变，正相关的细胞群中差异性很大，而负相关的细胞群中差异性相对较小，这可能提示，宫颈癌中低表达的CRYAB导致造血干细胞、肿瘤相关成纤维细胞和内皮细胞大降减少，单核巨噬细胞、NK细胞、CD8+T细胞和B细胞增加，两者共同作用，促进癌症的发生发展。共表达基因GO注释发现，它们参与表皮发育、包膜角化、多肽交叉连接、钙离子结合和中间纤维细胞骨架组织等细胞功能，可以推测，CRYAB可能通过上述方式调节细胞周期，从而参与肿瘤的发生和进展。蛋白互作发现的重点分子SPRR1B和IVL已有报道与宫颈癌的调控相关[24-25]，这更提供了CRYAB作为相关因子参与宫颈癌调控的依据。KEGG通路分析显示共表达基因富集在金黄色葡萄球菌感染、黏蛋白O-聚糖生物合成、核苷酸糖的生物合成、IL-17信号通路和癌症的通路等，这为今后CRYAB在宫颈癌的通路研究提供了理论基础。

综合上述，CRYAB在宫颈癌中低表达，与宫颈癌的发生发展存在一定的关系，有望成为宫颈癌的生物标志物和潜在的治疗靶点。