黄毛草莓叶片愈伤组织诱导研究

钱邵函 刘倩文 武春霞

摘    要：为建立黄毛草莓叶片繁殖体系，筛选诱导愈伤组织的最适培养基，以黄毛草莓幼嫩叶片为外植体，研究了消毒时间、激素组合、光暗条件对黄毛草莓叶片愈伤组织诱导的影响。结果表明：黄毛草莓叶片最佳的外植体消毒处理为0.1%的升汞消毒6～8 min;黄毛草莓叶片愈伤组织褐化严重，经15%抗坏血酸（Vc）溶液浸泡20 min可显著降低褐化率，提高出愈率;愈伤组织诱导的最适培养基组合为MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA和MS+1.0 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 IBA;暗培养10 d出愈率最高，可达到87.5%。因此，黄毛草莓叶片愈伤组织诱导最佳培养方法为：MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+30 g·L-1 蔗糖+7 g·L-1 琼脂，培养基pH值为 5.6，15%Vc溶液浸泡20 min，出愈率可达到95.0%。

关键词：黄毛草莓;叶片;愈伤组织;诱导

中图分类号：S668.4       文献标识码：A          DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.06.008

Study on Callus Induction of Fragaria nilgerrensis Leaves

QIAN Shaohan， LIU Qianwen， WU Chunxia

（College of Horticulture Landscape， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）

Abstract：  In order to establish an efficient method for plant regeneration from leaf explant of Fragaria nilgerrensis plantlet the most suitable medium for inducing callus was screened. The leaves of Fragaria nilgerrensis plantlet were used for studying the effects of disinfection time， plant growth regulator concentration and ratio， different incubation time in dark， on callus induction in leaves were studied using the young and tender leaves of Fragaria nilgerrensis as explants. The results showed that the optimal explant disinfection treatment for 0.1% of the leaves of Fragaria nilgerrensis was 0.1% mercury disinfection for 6-8 minutes， and the callus of Fragaria nilgerrensis leaf was severely browned， and the browning rate and callus induction rate could be significantly reduced by soaking in 15% ascorbic acid （Vc） solution for 20 minutes. The optimal medium combination for callus induction was MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA and MS+1.0 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 IBA for 10 d in dark， the callus induction frequency was up to 87.5%. The best cultivation method is MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+30 g·L-1 sucrose+7 g·L-1 Agar-Agar， medium pH 5.6 and soaks in 15%Vc solution for 20 minutes， the callus induction frequency is up to 95%.

Key words： Fragaria nilgerrensis; leaf; callus; induction

黃毛草莓（Fragaria nilgerrensis Schlecht. ex Gay）是蔷薇科（Rosaceae）草莓属（Fragaria L.）多年生二倍体草本植物，具有较强的抗病抗旱抗寒能力，在世界各地广泛栽培[1-2]。黄毛草莓中富含的氨基酸总量在野生草莓资源中相对较高，具有较高的营养价值，是培育具有高氨基酸含量果品的宝贵野生资源[3]。就目前草莓发展的趋势来看，野生种质资源在改善草莓品种特性上具有极大的应用潜力。

匍匐茎分株法普遍用于草莓的无性繁殖，这种方法繁殖系数较低、速度较慢，并且特别容易感染病毒而使种苗退化[4]，导致草莓的产量和品质下降，不利于优良品种的推广，不能满足大范围生产的需要。此外，在黄毛草莓引进后，其大规模种苗生产技术还不够完善，加上作物多倍体的特性，制约了传统的育种方法。草莓的组培技术则可以获得无毒苗以保持其品种的优良特性[5-6]。目前，关于国内草莓的组培研究大多集中于草莓的茎尖培养[7-9]，对于叶片繁殖的研究较少，不少草莓生产基地对草莓组培和扩繁等进行了系统的研究。晁慧娟等[10]以‘甜查理’草莓叶片为试验材料，对其进行组培，得出一组适宜叶片诱导愈伤组织的激素组合水平，试验结果表明：叶片诱导愈伤培养基最佳组合为MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA出愈率92.5%。刘玲等[11]用TDZ与IBA激素的不同浓度组合诱导黄毛草莓离体叶片愈伤组织形成。试验结果表明，诱导叶片愈伤组织形成得最佳培养基为MS+1.0 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 IBA出愈率95.4%。本试验设置了2种植物激素组合，6-BA和 NAA为一组、TDZ和IBA为一组，研究黄毛草莓叶片不同消毒处理、不同水平激素组合和添加15%抗坏血酸以及不同暗处理时间下愈伤组织诱导的状况，以期得到适合黄毛草莓叶片诱导出愈伤组织的植物激素组合水平，为黄毛草莓快速繁殖和育种奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验材料为当年生的黄毛草莓叶片，采集地点为天津农学院西校区（39°16' N，116°97' E）。

1.2 试验方法

1.2.1 外植體的消毒 摘取幼嫩的黄毛草莓叶片放入干净的烧杯中，滴入几滴洗洁灵，将表面附带的灰尘等杂物用清水冲洗干净，再将洗净的叶片放置于超净工作台上进行消毒灭菌。用浓度为75%的酒精浸泡30 s后用无菌水清洗1遍，转入0.1%的升汞溶液分别消毒4，6，8，10 min，再用无菌水冲洗叶片4～5次，最后用消毒好的剪刀去除掉叶片的边缘，将其剪成约0.5 cm×0.5 cm的外植体（保留主脉）备用。

1.2.2 不同激素组合水平培养基的接种 以MS培养基为基本培养基，添加7 g·L-1琼脂、30 g·L-1蔗糖，将pH 值调为5.8。6-BA和NAA为一组，TDZ和IBA为一组，并设定浓度6-BA为0.5，1.0，1.5 mg·L-1，NAA为0.05，0.10，0.15 mg·L-1，TDZ为0.5，1.0，1.5 mg·L-1，IBA为0.1，0.2，0.3 mg·L-1。将处理好的黄毛草莓叶片接种于含有不同6- BA和NAA、TDZ和IBA浓度组合的MS培养基中，接种时将叶子的背面朝下与培养基接触，每瓶接种5个外植体，50 d后统计出愈率;为了使褐化现象减小，将处理好的叶片放于配制好的15%的抗坏血酸（Vc）溶液中浸泡20 min，然后按照上述的方法重新接种。

1.2.3 暗培养时间的设置 设置暗培养天数5，10，15，20 d ，暗培养结束后将其转入到光照下培养;将已经接种好黄毛草莓叶片的培养基直接置于光照下培养（暗培养0 d）设对照。每个处理接种8瓶（培养基为 MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA），每瓶培养基接种5个处理好的叶片。接种后30 d观察并记录草莓叶片愈伤组织的诱导情况，统计出愈率。

1.2.4 培养条件 光照强度2 500 lx，温度25 ℃。每天观察并记录黄毛草莓叶片的变化，50 d后统计出黄毛草莓愈伤组织的诱导情况。

1.2.5 数据统计与分析 试验数据均采用Excel 2007和SPSS19.0进行数据统计与统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间长度对外植体的影响

从表1可以看出，当消毒时间为4 min时，褐变率为20%，叶片受到的损伤比较小，颜色发绿，但是在培养基中污染比较严重，污染率为85%，说明消毒不够充分，使菌类物质抑制愈伤组织的发生;当消毒时间为10 min时，褐变率为24%，叶片受到的损伤比较严重，颜色变成黑褐色，但是没有污染的情况，说明消毒时间过长;当消毒时间为6～8 min时，叶片在培养基上萌发的数目比较多，污染相对较少。

2.2 暗培养对叶片愈伤组织的诱导

从表2可以看出，随着暗培养时间的递增，产生愈伤组织的数量逐渐增加，出愈率也逐渐增高，第10天出愈率达到最高，为87.5%，极显著高于其他暗培养天数;继续增加暗培养的天数，产生愈伤组织的数量逐渐递减，出愈率显著降低，第20天出愈率下降到37.5%。由此可知，暗培养的时间为10 d时，比较适宜黄毛草莓叶片诱导出愈伤组织。

2.3 不同6-BA和NAA浓度组合和添加抗坏血酸对叶片愈伤组织诱导的影响

由表3可知，将黄毛草莓叶片接种到含有不同6-BA和NAA浓度组合的培养基中培养50 d之后，所有的处理都出现了不同程度的褐化现象。为了使褐化程度消失或减小，本试验采用现配制好的15%Vc溶液浸泡叶片20 min。结果表明，9个处理的褐化程度都显著降低，出愈率都明显增加。未经15%Vc溶液处理时，处理1的出愈率为15%，显著低于其他组合，褐化率为95%，显著高于其他组合;处理5的出愈率最高为75%，褐化率最低为46.67%，与其他组合差异显著。经过15%Vc溶液浸泡后，处理1的出愈率与处理前相比增加了20%，其褐化率降低了29.67%;处理5的出愈率为86.67%，与处理前相比增加了11%，显著高于其他组合，褐化率为6.67%，与未经15%的Vc溶液处理相比褐化率降低了39%，显著低于其他组合。50 d左右愈伤组织增殖明显，覆盖整个叶片，呈淡黄色。综上得出，黄毛草莓叶片愈伤组织诱导适宜的激素组合是处理5（MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA）。

2.4 不同TDZ和IBA浓度组合和添加抗坏血酸对叶片愈伤组织诱导的影响

黄毛草莓叶片接种后，在培养过程中有小部分叶片发生褐化，大部分叶片都能保持绿色，在接种后10 d，叶片中间开始膨胀，呈拱状，之后在伤口处出现膨大现象;培养15 d后，黄毛草莓叶片膨大部分转变成为淡黄色的愈伤组织。继续进行培养，愈伤组织逐渐变大增多，颜色逐渐转变为黄褐色。

由表4可知，黄毛草莓叶片在含有不同TDZ和IBA浓度组合的 MS培养基中培养50 d，出愈率均较高，最高可达到90%，但在不同的培养基中，其出愈状况差异明显，并且所有处理的褐化情况表现出了明显的不同。为了使褐化情况减弱，本试验用现配制好的15%Vc溶液浸泡叶片20 min，结果发现，9个处理的褐化情况都显著降低。在未经Vc处理的情况下，处理10的出愈率为25%，显著低于其他处理组合，褐化率为86.67%，显著高于其他处理组合;处理13的出愈率为90%，显著高于其他处理组合，褐化率最低为5.67%。经过15% Vc处理后，处理10的出愈率增加了30%，褐化率降低了30%;处理13的出愈率为95%，与未经15% Vc处理相比分别增加了5%，显著高于其他组合，褐化率为2.76%，与未经15% Vc处理相比降低了3%，显著低于其他组合。综上得出，最适宜黄毛草莓叶片愈伤组织诱导的培养基是处理13（MS+1.0 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 IBA）。

3 结论与讨论

消毒时间的长短对于愈伤组织诱导有着非常重要的影响。大多数研究认为，消毒时间如果太短（如1 min）则无法控制污染，如果时间太长（如7 min）会损伤叶片，变褐死亡率升高[12]。本试验适宜的消毒时间为6～8 min，說明黄毛草莓叶片消毒超过7 min也可以达到良好的灭菌效果。这可能是因为黄毛草莓叶片上下表皮具有较多的绒毛，可以减少消毒溶液对叶片的损伤。

叶片愈伤组织诱导的培养，需要一定时间暗培养的处理，才能达到适宜的培养条件，这一结论在许多草莓的离体叶片诱导愈伤组织的试验中也得到了证实。王梅[13]在试验中进行了2个草莓品种的比较，发现暗培养10 d可以使红颜草莓的出愈率达到最高。本试验在暗培养10 d时出愈率达到最高，与上述结论一致。在叶片愈伤组织诱导的过程中，选取适合的细胞分裂素浓度对于提高愈伤组织的生成率有着至关重要的影响。周厚成等[14]将生长素NAA的浓度定为0.1，0.2 mg·L-1时，发现愈伤组织的生成能力可高达98.9%，但随着NAA浓度的增加，愈伤组织的生成能力逐渐下降。付崇毅等[15]研究发现，当6-BA浓度低于1.5 mg·L-1时，随着6-BA浓度的升高，草莓茎尖愈伤组织萌发率升高，褐化率显著降低，将6-BA浓度提高到2 mg·L-1时，草莓茎尖愈伤组织褐化率显著提高。因此，本试验中使用较低浓度的生长素NAA和细胞分裂素6-BA结合，促进叶片愈伤组织的诱导，根据愈伤组织的出愈率和褐化率，从而得出适宜黄毛草莓叶片诱导愈伤组织的植物激素组合水平。本试验结果显示，TDZ与IBA的处理组合1.0 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 IBA配合MS培养基效果最佳，出愈率为90%，这与刘玲等[11]研究结果一致。将2组激素组合进行比较，笔者发现TDZ与IBA的处理组合比6-BA与IAA的处理组合诱导愈伤组织效果好，添加了TDZ和IBA的培养基能使出愈率最高达到90%，而添加了6-BA和NAA的培养基最高出愈率只能达到75%。这可能是由于 TDZ具有较高的细胞分裂能力，使愈伤组织在培养中积累较多的养分，从而促进了愈伤组织的形成。褐化是植物组织培养中最常见的问题，褐化产生的酚类物质影响愈伤的生长， 严重时导致愈伤死亡，抗坏血酸（Vc）作为一种抗褐化剂能有效消除有毒有害物质的积累，提高愈伤组织的诱导率[16]。本试验发现，接种前将外植体用15%Vc浸泡20 min后，所有激素处理组合的出愈率和褐化率与未进行15%Vc浸泡处理的激素处理组合相比，均有不同程度的升高和降低，与前人研究结果一致[16]，其出愈率最高增加了30%，褐化率最高降低了67.33%。这说明在培养基中添加适合浓度的Vc能够有效预防外植体褐化，促进愈伤组织的生成。

综上所述，用0.1%升汞对外植体消毒，消毒时间为6～8 min时，诱导出的愈伤组织，褐化较少，污染小。对外植体进行暗处理10 d，再转移到光照下培养，出愈率最高可达到87.5%，对外植体进行15%Vc浸泡处理能有效降低褐化率，提高出愈率。从不同激素组合水平的处理来看，在18组激素处理中，相对较适宜黄毛草莓叶片愈伤组织诱导的培养基是处理13（MS+1.0 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 IBA）和处理5（MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA）。本试验筛选出适宜黄毛草莓叶片愈伤组织诱导的一系列最适培养条件，为草莓叶片愈伤组织培养提供了一定的理论基础。

参考文献：

[1] 苏代发， 童江云， 杨俊誉， 等. 中国草莓属植物种质资源的研究、开发与利用进展[J]. 云南大学学报（自然科学版）， 2018， 40（6）： 1261-1276.

[2] 汉由之. 黄毛草莓杂交与辐射育种后优良植株的筛选[D]. 北京： 北京林业大学， 2014.

[3] 雷家军， 代汉萍， 葛会波， 等. 草莓六倍体种间杂种及其回交研究[J]. 园艺学报， 2004， 31（4）： 496-498.

[4] 孙艳平， 庞兴城， 韩金伟. 脱病毒草莓高产优质栽培技术[J]. 现代农业， 2011（6）： 20.

[5] 金美芳， 曹智， 蔡俊杰， 等. 红花草莓的组织培养与快繁技术研究[J]. 广西植物， 2017， 37（11）： 1395-1405.

[6] 窦炎丹. “白雪公主” 草莓快繁和超低温处理体系的建立以及抗生素抗性研究[D]. 石家庄： 河北经贸大学， 2019.

[7] 牟彤， 吴瑕， 胡鑫宇. 不同激素条件对草莓组培苗快繁的影响[J]. 安徽农学通报， 2010， 16（5）： 78， 167.

[8] 王振磊， 闫芬芬， 王静， 等. 草莓组培快繁技术研究[J]. 北方园艺， 2012（11）： 130-132.

[9] 翟婷婷， 刘成连， 原永兵， 等. 草莓茎尖培养快繁体系的研究[J]. 安徽农业大学学报， 2015， 42（4）： 545-548.

[10] 晁慧娟， 董莉， 姬谦龙， 等. “甜查理”草莓叶片再生体系的建立[J]. 北京农学院学报， 2009， 24（4）： 11-13.

[11] 刘玲， 葛春峰， 王涛， 等. 黄毛草莓叶片离体再生及其同源四倍体的诱导[J]. 核农学报， 2017， 31（1）： 51-58.

[12] 杨秀莲， 胡蝶， 宋佳妮， 等. 海州常山叶片愈伤组织诱导及不定芽再生[J]. 东北林业大学学报， 2018， 46（7）： 28-32， 101.

[13] 王梅. 草莓叶片不定芽发生及抗生素及其影响的研究[D]. 雅安： 四川农业大学， 2005.

[14] 周厚成， 罗静， 赵霞， 等. 不同培养条件对幸香草莓离体叶片再生的影响[J]. 果树学报， 2007， 24（1）： 105-108.

[15] 付崇毅， 姜伟， 王建国， 等. 草莓茎尖组织培养防褐化及玻璃化研究[J]. 北方农业学报， 2016， 44（1）： 46-51.

[16] 吕宗友， 苏衍菁， 赵国琦， 等. 不同防褐化措施对苏丹草愈伤诱导以及抗褐化的效果研究[J]. 草业学报， 2011， 20（3）： 174-181.