结直肠癌组织EGFR、BRAF及NRAS基因突变检测及临床意义分析

符青云，欧阳小明，郅 程，何凯宁

（1.江门市五邑中医院病理科，广东 江门 529000；2.广州医科大学附属第二医院病理科，广东 广州 510260）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是消化系统最常见的肿瘤之一，我国结直肠癌的发病率、死亡率在全部恶性肿瘤中均位居第5 位[1]，是威胁国民健康的重大公共卫生问题。目前对于CRC 的治疗已进入了靶向治疗时代，近年来应用基因检测的方法在CRC 患者实施靶向治疗的过程中检测相关基因的突变，在判断CRC 预后及指导基因靶向治疗中起到关键的作用[2，3]。表皮生长因子受体（EGFR）是靶向治疗药物作用主要靶点之一，ErbB 受体家族的成员，也是一种Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生长因子受体，大小为170 ku 的跨膜糖蛋白，广泛存在于不同肿瘤表面，在许多恶性肿瘤的增殖、分化、转移中发挥重要作用[4，5]。有研究表明[6]，淋巴结转移及胸膜转移与表皮生长因子受体突变状态的存在一定联系。致癌同源体B1（carcinogenic homolog B1，BRAF）基因和神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物（neuroblastoma RAS viral oncogene homolog，NRAS）基因同属RAF 家族中的一种原癌基因，已发现其在多种肿瘤中存在突变[7]。致癌同源体B1 突变导致丝裂原活化蛋白激酶信号通路持续激活，引起细胞生长增殖和侵袭转移，从而影响肿瘤的发展进程[8]，而神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突变的报道相对较少。既往研究表明[9]，致癌同源体B1 基因和神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突变与CRC患者的淋巴结转移和临床分期相关。本研究分析了CRC 组织中表皮生长因子受体、致癌同源体B1 及神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突变类型及其与临床病理指标的关系，旨在为临床实施个体化靶向治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017 年1 月-2018 年12 月江门市五邑中医院病理科确诊的321 例CRC 患者的临床资料。其中男125 例，女196 例；年龄40～80 岁，平均年龄（58.91±10.27）岁；年龄＞60 岁148 例，≤60岁173 例。肿瘤部位：结肠168 例，肿瘤直肠153 例；病理组织学分级：低分化113 例，中/高分化208 例；检出淋巴结转移196 例，未检出淋巴结转移125 例；TNM 分期：Ⅰ+Ⅱ期102 例，Ⅲ+Ⅳ期219 例。患者及家属对本次研究均知情同意，并签署知情同意书。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准 所有患者均经过病理组织学检查，诊断为CRC，且未接受放化疗或免疫治疗等。

1.2.2 排除标准 合并溃疡性结肠炎、肠道感染性疾病等；合并其他恶性肿瘤病史；合并严重的肝肾等脏器功能障碍。

1.3 试剂 石蜡包埋组织样本DNA 分离试剂盒（DP331）购自北京天根生化科技有限公司；人类表皮生长因子受体、致癌同源体B1 和神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突变检测试剂盒购自北京雅康博生物科技有限公司；核酸蛋白质浓度测量仪B-500 购自上海创萌生物科技有限公司，Mx3000P 实时荧光定量PCR 仪购自美国BIO-RAD公司。

1.4 提取DNA 选取5～10 张4 μm 厚癌组织常规石蜡切片，利用二甲苯脱蜡，加入裂解液，离心取上清液，使用TIANGEN 石蜡包埋组织样本DNA 分离试剂盒进行DNA 提取，具体步骤严格遵照试剂盒说明书进行。用核酸蛋白质浓度测量仪测定所提DNA 的浓度。调整最适质量浓度为20 μg/L，OD260/OD280值1.8～2.0。

1.5 实时荧光定量PCR 检测基因突变 以调整合适浓度的DNA 为模板，使用人类表皮生长因子受体、致癌同源体B1 和神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突变检测试剂盒，在实时荧光定量PCR 仪中进行扩增，检测表皮生长因子受体基因第18、19、20、21 外显子、致癌同源体B1 基因15 号外显子、神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因第2 和第3 外显子的热点突变，记录各样本表皮生长因子受体、致癌同源体B1、神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物3 个基因突变情况。具体步骤严格遵照试剂盒说明书进行。

1.6 随访 所有患者治疗出院后均进行随访，随访时间自病理活检日期起开始经门诊复查、电话随访及家访，治疗后1 年内每3 个月经门诊复查1 次，2 年内半年复查1 次，以后至少每年复查1 次，随访截止2021 年6 月。至随访截止日记录患者期间生存时间及随访时状态（存活、死亡、失访或其他）等。

1.7 观察指标 分析CRC 患者组织中表皮生长因子受体、致癌同源体B1 和神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突变情况；比较不同性别、年龄、肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移、病理分期3 种基因突变类型、突变率；Pearson 相关性分析CRC 中表皮生长因子受体、致癌同源体B1 和神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物表达的关系，Kaplan-Meier分析3 个基因突变对总生存期（overall survival，OS）和无进展生存期（progression-free survival，PFS）的影响。

1.8 统计学方法 本研究采用SPSS 20.0 统计软件进行处理，计量资料采用（±s）表示。计数资料采用[n（%）]表示，表皮生长因子受体、致癌同源体B1 和神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突变率在不同年龄段、性别、肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移、病理分期的比较采用χ2检验。通过Kaplan-Meier 方法绘制患者的生存曲线，组间差异采用Log-rank 检验评估。表皮生长因子受体、致癌同源体B1 和神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因之间的相关性采用Pearson 分析。当P＜0.05 时表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRC 患者组织中EGFR、BRAF 和NRAS 基因突变情况 321 例CRC 患者中共检出阳性突变179例，占总数的55.76%。总突变率由高至低依次为表皮生长因子受体、致癌同源体B1、神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物。表皮生长因子受体中L858R 突变频率最高，致癌同源体1 中V600E 突变频率最高，神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物中G13R 突变频率最高，各突变类型的突变率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 EGFR、BRAF 和NRAS 常见基因突变类型分析[n（%）]

2.2 EGFR、BRAF 和NRAS 基因突变与临床特征之间的关系 在321 例CRC 患者中，表皮生长因子受体基因突变发生率与性别、分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关（P＜0.05），而与年龄、肿瘤部位无关（P＞0.05）；致癌同源体1 基因突变发生率与年龄、淋巴结转移有关（P＜0.05），而与性别、肿瘤部位、分化程度及TNM 分期无关（P＜0.05）；神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突变发生率与年龄、性别、肿瘤部位、分化程度及TNM 分期均无关（P＞0.05），见表2。

表2 EGFR、BRAF 和NRAS 基因突变与临床特征之间的关系[n（%）]

2.3 EGFR、BRAF 和NRAS 在CRC 中突变的相关性CRC 组织中表皮生长因子受体和致癌同源体B1 突变呈正相关（r=0.468，P＜0.05）；CRC 组织中致癌同源体B1 和神经母细胞瘤RAS 病毒基因同源物突变呈正相关（r=0.457，P＜0.05）；CRC 组织中表皮生长因子受体和神经母细胞瘤RAS 病毒基因同源物突变呈正相关（r=0.357，P＜0.05）。

2.4 EGFR、BRAF 和NRAS 基因突变对总生存期和无进展生存期的影响 截止至随访时间结束，表皮生长因子受体野生型患者3 年OS 为49.00%，高于表皮生长因子受体突变型患者的38.00%，差异有统计学意义（Log-rankχ2=9.232，P=0.002）；表皮生长因子受体野生型患者3 年PFS 为31.00%，高于表皮生长因子受体突变型患者的25.00%，差异有统计学意义（Log-rankχ2=5.419，P=0.019）。致癌同源体B1野生型患者3 年OS 为47.00%，高于致癌同源体B1 突变型患者的40.00%，差异有统计学意义（Log-rankχ2=7.694，P=0.005）；致癌同源体B1 野生型患者3 年PFS 为32.00%，高于致癌同源体B1突变型患者的24.00%，差异有统计学意义（Logrankχ2=7.631，P=0.006）。神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物野生型患者3 年OS 为45.00%，高于神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物突变型患者的42.00%，但差异无统计学意义（Log-rankχ2=3.082，P=0.079）；神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物野生型患者3 年PFS 为33.00%，高于神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物突变型患者的23.00%，差异无统计学意义（Log-rankχ2=1.139，P=0.285），见图1。

图1 EGFR、BRAF 和NRAS 基因突变对OS 和PFS 的影响

3 讨论

CRC 的发生发展涉及多个基因、多个信号通路、多个步骤。其发展进程不仅与肠上皮细胞的凋亡、增殖速度密切相关，也涉及多种癌基因的激活、抑癌基因的失活，以及表观遗传学的改变[10-12]。目前表皮生长因子受体基因是临床上治疗CRC 的主要靶点之一，首选靶向药物为表皮生长因子受体抑制剂西妥昔单抗和帕尼单抗等。作为一种跨膜酪氨酸激酶受体，表皮生长因子受体配体与之结合后，下游的RAS/RAF/MAPK 和PIK3CA/AKT 信号通路被激活，而这两条信号通路与细胞的增殖、分化及凋亡、迁移等有密切关系[13]。神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物和致癌同源体B1 同属RASRAF-MAPK 信号通路，其与肿瘤的发生、发展密切相关[14-16]。表皮生长因子受体靶向治疗的效果受很多因素的影响，其中表皮生长因子受体、神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物和致癌同源体B1 等基因的突变与表皮生长因子受体靶向治疗密切相关[17]，因此治疗靶点的检测是临床进行个体化治疗的前提。

CRC 中表皮生长因子受体基因突变率在40%～60%，其中L858R 类型的突变频率最高。本研究发现表皮生长因子受体基因总突变率为45.79%，并与CRC 组织的性别、分化程度、淋巴结转移、TNM 分期有关，表皮生长因子受体基因突变患者的预后较差，与Afrǎsânie VA 等[18]的研究报道基本一致。表皮生长因子受体泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，其信号通路由表皮生长因子激活，使其中的蛋白酪氨酸激酶活性增强；受体自身的酪氨酸残基发生磷酸化，活化下游多种信号通路从而传递到细胞核内，对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。表皮生长因子受体过度表达、失调、突变或自我激活常提示与肿瘤的发生发展有关，可作为预测CRC 发展进展、预后的标志物[19，20]。

本研究发现致癌同源体B1 基因总突变频率为7.79%，其中V600E 突变率为4.05%，与相关报道显示CRC 中致癌同源体B1 基因突变率在4%～13%，其中V600E 突变率接近50%的结果基本一致。致癌同源体B1 基因突变与CRC 组织的年龄、淋巴结转移有关，与表皮生长因子受体结果部分一致，表明致癌同源体B1 基因与表皮生长因子受体基因突变可能互相影响，共同发挥作用。既往有研究对166 例CRC 患者癌组织进行致癌同源体B1基因分析，本研究结果在肿瘤分化、病理浸润深度、淋巴结转移方面存在与该研究部分相似的结果[21]。此外，致癌同源体B1 基因V600E 在CRC 中的突变率为4.0%，与既往文献报道相似[22]。致癌同源体B1 基因突变生存表明突变型和野生型患者术后生存率存在差异，随着生存时间的延长，突变型患者的生存率显著下降。另有研究也认为致癌同源体B1基因突变的CRC 患者也会发生靶向药物抵抗[23]，致癌同源体B1 基因突变是帕尼单抗和西妥昔单抗[24]预后疗效的独立预测因素[25-28]。

神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因是RAS 基因家族中的一员，在CRC 中突变率为3%～8%，其突变状态对于CRC 靶向药物的治疗效果具有重要意义。本研究结果显示，CRC 组织中神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突变检出率为2.18%，与Hsu CH 等[29]结果类似。本研究未发现神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突变与CRC 的性别、年龄、肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移、TNM 病理分期等临床病理特征存在关联，但45岁以下的患者中未检出神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物突变，检出神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物突变的病例最小年龄是48 岁；肿瘤部位在直肠的癌组织中神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突变检出率较高。因此推测患者年龄、肿瘤部位可能与神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突变有一定关联。然而本研究仅为单中心研究，样本量有限，需要增加样本量进行验证。神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突变生存分析结果表明突变型和野生型患者术后生存率无统计学差异。此外，本研究还发现，CRC 组织中表皮生长因子受体、致癌同源体B1 和神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物突变两两之间存在一定的相关性。

综上所述，CRC 患者存在较高的表皮生长因子受体基因突变率，而致癌同源体B1 和神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物基因突变率相对较低。表皮生长因子受体基因突变与性别、分化程度、淋巴结转移、TNM 分期有关，且致癌同源体B1 基因突变与年龄、淋巴结转移有关，存在部分交叉。突变患者将不能从抗表皮生长因子受体的靶向治疗中获益，建议CRC 患者在用靶向治疗药物（如西妥昔单抗和帕尼单抗等）之前应先对CRC 患者进行表皮生长因子受体、神经母细胞瘤RAS 病毒癌基因同源物、致癌同源体B1 等多基因检测，为CRC 的个体化治疗提供更准确的参考依据。