基于响应面法的台湾香荚兰总黄酮提取工艺优化及抗氧化活性研究*

杨一山，唐健民，秦惠珍，罗亚进，邓振海，柴胜丰**

(1.广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西植物功能物质研究与利用重点实验室，广西桂林 541006；2.桂林医学院药学院，广西桂林 541004；3.广西雅长兰科植物国家级自然保护区管理中心，广西百色 533209)

1 材料与方法

1.1 材料

芦丁对照品(B20771-100 mg，上海源叶生物科技有限公司，HPLC≥98%)，无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、L-抗坏血酸、DPPH、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢、三羟基氨基甲烷(Tris)、邻苯三酚、盐酸、磷酸盐缓冲液、三氯乙酸、铁氰化钾、三氯化铁等试剂均为分析纯。台湾香荚兰(VanillasomaiHayata)全株采自广西雅长兰科植物国家级自然保护区。

仪器：TU-1901型双光束紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司；DL-720E智能超声波和万分之一电子分析天平购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；HH-S4数显恒温水浴锅购自金坛双捷实验仪器厂；QE-100高速粉碎机购自浙江屹立工贸有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

将采集到的台湾香荚兰洗净，在60℃的条件下烘干48 h，粉碎后过60目筛，制成样品粉末，备用。

1.2.2 对照品溶液的制备

精密称取0.012 5 g芦丁对照品，用60%乙醇定容于25 mL的容量瓶中，摇匀，制成0.500 mg/mL的对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备

准确称取0.5 g样品粉末，按照1∶50 (g/mL)的料液比，加入50%乙醇25 mL，在60℃、300 W的条件下超声辅助提取30 min，过滤，复提3次，然后定容于100 mL容量瓶中，即得。

1.2.4 最大吸收波长的确定

精密吸取1.2.2节对照品溶液和1.2.3节供试品溶液各2 mL，分别置于25 mL容量瓶中，各瓶中加入5%亚硝酸钠溶液2 mL，摇匀后放置6 min，加入5%硝酸铝溶液2 mL，摇匀后放置6 min，加入4%氢氧化钠溶液4 mL，摇匀后用60%乙醇稀释至刻度线，放置15 min后，用蒸馏水代替供试品溶液并以相同方法处理后的空白试剂作为参比溶液，于300-600 nm波长下扫描，发现在510 nm处吸光值最大，故选择510 nm作为最大吸收波长。

1.2.5 标准曲线的制备

分别精密吸取0.0 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL对照品溶液置于25 mL容量中，用60%乙醇加至2.0 mL，按照1.2.4节方法加样操作，于510 nm下测定吸光值。以芦丁的浓度(mg/mL)为横坐标，吸光值作为纵坐标，制作标准曲线，并计算回归方程。得到回归方程：y=11.743x+0.002 (R2=0.999 3)。

1.3 单因素试验

1.3.1 提取时间对台湾香荚兰总黄酮含量的影响

准确称取样品粉末0.5 g，按照1∶50 (g/mL)的料液比，加入50%乙醇25 mL，在60℃、300 W的条件下分别超声辅助提取10 min、30 min、60 min、90 min、120 min，过滤，复提3次，然后定容于100 mL的容量瓶中。之后，按照1.2.4节方法加样操作，于510 nm处测定吸光值，最后计算出不同提取时间下的总黄酮含量。每种处理做3组重复。选取最佳提取时间，进行下一步单因素试验。

1.3.2 乙醇浓度对台湾香荚兰总黄酮含量的影响

准确称取样品粉末0.5 g，按照1∶50 (g/mL)的料液比，分别加入40%、50%、60%、70%、80%的乙醇25 mL，在60℃、300 W的条件下分别超声辅助提取30 min，过滤，复提3次，然后定容于100 mL的容量瓶中。之后，按照1.2.4节方法加样操作，于510 nm处测定吸光值，最后计算出总黄酮含量。每种处理做3组重复。选取最佳乙醇浓度，进行下一步单因素试验。

1.3.3 料液比对台湾香荚兰总黄酮含量的影响

准确称取样品粉末0.5 g，按照1∶20 (g/mL)、1∶30 (g/mL)、1∶40 (g/mL)、1∶50 (g/mL)、1∶60 (g/mL)的料液比，加入50%乙醇，在60℃、300 W的条件下分别超声辅助提取30 min，过滤，复提3次，然后定容于100 mL的容量瓶中，之后，按照1.2.4节方法加样操作，于510 nm处测定吸光值，最后计算出总黄酮含量。每种处理做3组重复。

1.4 响应面分析

根据单因素试验结果，利用Design Expert 8.0.6 软件设计响应面试验。以提取时间(A)、乙醇浓度(B)、料液比(C)为自变量，以台湾香荚兰的总黄酮含量(Y)为考察指标，共计17个试验点进行组合试验，因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平

1.5 抗氧化活性的测定

根据以上试验结果，采用最佳提取工艺对台湾香荚兰中的总黄酮进行提取，并将提取液(0.059 5 mg/mL)稀释成0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL 5个浓度的样品测试液，用于对台湾香荚兰总黄酮的抗氧化活性进行综合评价。

1.5.1 台湾香荚兰总黄酮对DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力的测定参考宋佳敏等[7]的方法，并稍做调整。分别取5个浓度的4 mL样液于试管中，加入等体积的0.1 mmol/L的DPPH溶液，充分混匀后，在室温下避光保存30 min，用无水乙醇作参比溶液(下同)，于517 nm处测定样品液中的吸光值，记为A1；4 mL样液与无水乙醇等体积混合后测定吸光值，记为A2；用4 mL蒸馏水代替样液，与4 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液混合后测定吸光值，记为A0。以相同浓度的L-抗坏血酸作阳性对照。

1.5.2 台湾香荚兰总黄酮对羟基自由基(·OH)清除能力

羟基自由基(·OH)清除能力的测定参考Fenton反应体系[8]，并稍做调整。取2.0 mL不同浓度梯度的样品溶液，依次加入1.0 mL 2.5 mmol/L的水杨酸溶液、1.0 mL 5 mmol/L的FeSO4溶液和2.0 mL蒸馏水，充分混匀后加入1.0 mL 5 mmol/L的H2O2溶液来启动反应，在37℃恒温水浴30 min后，用蒸馏水作参比溶液(下同)，于510 nm处测定吸光值，记为As；用1.0 mL蒸馏水代替H2O2溶液处理的样品溶液，测定的吸光值记为Ab；用2.0 mL蒸馏水代替样品溶液，测定的吸光值记为Ap。以相同浓度梯度的L-抗坏血酸作阳性对照。

羟基自由基(·OH)清除率(%)=

1.5.3 台湾香荚兰总黄酮对超氧阴离子自由基

1.5.4 台湾香荚兰总黄酮总还原力测定

总还原力的测定参考朱成豪等[10]的方法。取2.0 mL不同浓度梯度的样品溶液，先加入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸缓冲液(pH值为6.6)，再加入2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液，混匀后在50℃条件下水浴20 min，迅速冷却，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液来终止反应。取2.5 mL的上清液，加入2.5 mL的蒸馏水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，混匀，静置10 min后，用蒸馏水作参比溶液，于700 nm下测定吸光值。以相同浓度梯度的L-抗坏血酸作阳性对照。

1.6 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 18.0软件进行数据处理与分析，绘图采用Origin 2019软件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取时间对台湾香荚兰总黄酮含量的影响

由图1可知，台湾香荚兰的总黄酮含量随着提取时间的增加呈现先增加后降低的趋势，在提取时间为30 min时，总黄酮含量到达最高值1.053%，之后，随着提取时间继续增加，总黄酮的含量则逐渐降低。

图1 提取时间对台湾香荚兰总黄酮含量的影响

2.1.2 乙醇浓度对台湾香荚兰总黄酮含量的影响

由图2可知，台湾香荚兰总黄酮含量随着乙醇浓度增加呈现先增加后降低的趋势，在乙醇浓度为50%时，总黄酮含量达到最高值1.250%。在此之后，随着乙醇浓度继续增加，总黄酮含量逐渐降低。

图2 乙醇浓度对台湾香荚兰黄酮含量的影响

2.1.3 料液比对台湾香荚兰总黄酮含量的影响

由图3可知，台湾香荚兰总黄酮含量随着料液比的增加呈现先增加后降低的趋势，当料液比增加到1∶50 (g/mL)时，总黄酮含量达到最高值0.962%，当料液比继续增加时，总黄酮含量呈现降低的趋势。

图3 料液比对台湾香荚兰总黄酮含量的影响

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验结果

根据表1设定的水平和因素，共计17个试验点，其中12个为析因点，5个为零点。各个水平下总黄酮含量见表2。

表2 响应面试验设计及结果

表3 回归模型的方差分析

2.2.2 响应面交互作用分析

利用Design Expert 8.0.6 软件，对A、B、C 3个因素进行交互并分析比较，分别做出AB、AC、BC 3个等高线图和响应面三维曲线图。由图4可知，在一定范围内，随着各因素数值的增加，总黄酮含量(响应值)也会随之增加；达到最高点后随着各因素数值继续增加，总黄酮含量(响应值)则会减少。坡度的大小，表明两个因素的交互程度，坡度越大，两个因素的交互作用就越强，反之则弱。两个因素形成的等高线越接近椭圆形，表示两者的交互作用越显著。由此可知，提取时间(A)与乙醇浓度(B)的交互效果大于提取时间(A)和料液比(C)的交互效果，大于乙醇浓度(B)和料液比(C)的交互效果，即AB>AC>BC。

图4 交互因素对台湾香荚兰总黄酮含量影响的响应面图

2.2.3 优化与验证试验结果

根据以上响应面模型和结果分析，得出台湾香荚兰总黄酮的最佳提取条件：提取时间为37.5 min，乙醇浓度为45.6%，料液比为1∶50.7 (g/mL)。在此条件下，模型预测台湾香荚兰的总黄酮含量为1.22%。为方便试验，将试验条件调整为38 min，乙醇浓度为46%，料液比为1∶51 (g/mL)，在此条件下进行3次平行验证试验，得到台湾香荚兰总黄酮的实际含量为1.19%，RSD值为0.65%(n=3)，与模型预测含量相差0.03%，表示该模型具有较高的可靠性，且提取工艺的重现性较好。

2.3 台湾香荚兰总黄酮的抗氧化活性

2.3.1 对DPPH自由基清除能力

图5 台湾香荚兰总黄酮对DPPH自由基清除能力

2.3.2 对羟基自由基清除能力

图6 台湾香荚兰总黄酮对羟基自由基(·OH)的清除能力

图7 台湾香荚兰总黄酮对超氧阴离子自由基的清除能力

2.3.4 总还原力

图8 台湾香荚兰总黄酮的总还原力

3 讨论

目前，总黄酮的提取方法主要有乙醇回流提取法、浸提法、超声辅助提取法和超临界萃取法等。本研究以台湾香荚兰为原料，采用超声辅助提取法提取其总黄酮。超声辅助提取是利用超声波的机械效应、空化效应以及热效应，加速分子的运动速度和穿透力，从而增加有效物质的溶出，超声辅助提取相对于其他提取方法，如回流法、浸渍法等，具有提取效率高、操作简单等优点。本研究将乙醇作为总黄酮的提取溶剂，符合黄酮类化合物易溶于乙醇等有机溶剂的特点，在一定范围内，总黄酮的含量随着乙醇体积分数的增加而增加，当超过一定限度后，过高的乙醇浓度使植物细胞外的渗透压大于细胞内，从而限制有效物质的溶出；就提取时间而言，一方面提取时间的增加一定程度上可以增加总黄酮的溶出，使提取效率提高，另一方面，超声时间的延长，可能会使部分黄酮类化合物结构被破坏以及增加其他类型化合物溶出，从而降低黄酮类化合物的含量；适当的料液比可以增加目标产物的溶出，而过大的料液比不但使产物的含量下降，还会造成溶剂的浪费。本研究通过单因素试验得到最佳试验点，再经过软件设计得到17个试验线和完整连续的面，最终在面中得到最佳值。通过响应面试验，不仅可以使目标产物的提取率达到最大，还节省了生产成本。

通过研究发现，台湾香荚兰中总黄酮的含量为1.19%，其总黄酮的还原能力为L-抗坏血酸的79.2%，对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的IC50值分别为0.012 3 mg/mL、0.015 9 mg/mL、0.032 6 mg/mL。与广东石豆兰[11]、石仙桃(PholidotachinensisLindl.)[12]等兰科药用植物相比，台湾香荚兰中的总黄酮具有较为突出的抗氧化能力，但总黄酮的类型还不明确，需要进一步分离和鉴定。

4 结论

本研究采用超声辅助提取的方法，对台湾香荚兰中的总黄酮进行提取与测定，并采用单因素试验和响应面交互试验相结合的方法，得出3个单因素对台湾香荚兰中总黄酮含量的影响大小为乙醇浓度(B)>提取时间(A)>料液比(C)，并确定了台湾香荚兰中总黄酮的最佳提取条件：提取时间为37.5 min，乙醇浓度为45.6%，料液比为1∶50.7 (g/mL)。在最佳提取条件下，台湾香荚兰中总黄酮的实际含量为1.19%，与预测值相差0.03%。台湾香荚兰总黄酮的还原能力为L-抗坏血酸的79.2%，对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子的IC50值分别为0.012 3 mg/mL、0.015 9 mg/mL、0.032 6 mg/mL，表明台湾香荚兰总黄酮具有较好的抗氧化活性，具有很好的开发利用前景。