慢性丙型肝炎患者血清N-寡糖和胆汁酸水平变化判断肝纤维化临床价值分析*

罗真真，田海英，葛建华，纪 元

慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染所致的慢性肝损伤性疾病。HCV感染慢性化的风险高于其他类型的嗜肝病毒感染[1]。目前认为，CHC患者肝纤维化进展与HCV基因分型有关，而基因3型HCV对肝细胞脂质代谢的影响较大，且与肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌的发生风险增加有关[2，3]。N-寡糖是结合糖蛋白的天冬酰胺侧链氨基上的分支寡糖链，主要由肝脏和B淋巴细胞合成，可反映肝脏细胞的生理改变[4]。总胆汁酸(total bile acid，TBA)是一项灵敏的肝功能检测指标，在肝细胞出现轻微损伤时就表现为明显的升高趋势。有研究发现，肝硬化患者血清TBA异常率很高[5]。肝脏硬度检测(liver stiffness measurement，LSM)是使用瞬时弹性成像技术检测的肝脏硬度变化的物理参数，具有无创、高效的特点。慢性乙型肝炎患者LSM随着肝纤维化程度的增加而升高[6]。本研究检测了CHC患者血清N-寡糖和TBA水平的变化，以探讨应用其判断肝纤维化的临床价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2018年6月～2021年6月我院收治的CHC患者84例，男51例，女33例；年龄为43～72岁，平均年龄为(58.7±5.6)岁。符合《丙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[7]的诊断标准。排除标准：①合并乙型肝炎病毒感染；②合并酒精性肝病、自身免疫性肝病；③合并恶性肿瘤。另选择健康体检者51例，男29例，女22例；年龄为40～69岁，平均年龄为(57.9±6.1)岁。两组人群性别和年龄比较无显著性差异(P>0.05)。

1.2 血清TBA水平检测 使用美国贝克曼库尔特公司生产的5831型全自动生化分析仪检测。

1.3 血清N-寡糖水平检测 取血清3 μL，加入10 mmol/L NH4HCO3缓冲液2μL和去离子水3μL，加入RCR反应板，95℃下加热5 min，放置于4℃环境，加入PNGase F(2.2 U/μL)3 μL，于37℃下孵育3 h，4℃水浴后加入去离子水100μL，终止反应，记为D板。从D板吸取10μL溶液，加入PCR反应板，在60℃下烘干约90 min，直至完全干燥。加入标记溶液3 μL，在90℃下反应2 h，加入去离子水终止反应。取样本2μL，加入唾液酸酶0.2 μL，震荡混匀后于42℃下孵育4 h，加去离子水终止反应。取10μL溶液，用ABI3500DX测序仪进行N-聚糖图谱分析，经GeneMapper软件处理，根据量化后的峰值数据计算N-寡糖相对水平。

1.4 LSM测定 使用法国Echosens 提供的Fibroscan-502 Touch仪器检测，于右腋中线第7、8或8、9肋间检测，连续有效检测10次，最终成功率大于60%，取均值。

1.5 肝活检 常规行肝活检，参照METAVIR评分系统[8]将肝纤维化分为S1、S2、S3和S4期。将肝纤维化程度分为进展期纤维化(S3～S4)和轻度纤维化(S1～S2)。

2 结果

2.1 两组血清N-寡糖、TBA水平和LSM比较 CHC组血清N-寡糖、TBA水平和LSM值显著大于对照组(P<0.05，表1)。

表1 两组血清N-寡糖、TBA水平和比较

2.2 不同纤维化分期的CHC患者血清N-寡糖、TBA水平和LSM值比较 随着肝纤维化程度的加重，CHC患者血清N-寡糖、TBA水平和LSM值逐渐显著升高或增大(P<0.05，表2)。

表2 不同纤维化分期患者血清N-寡糖、TBA水平和LSM值比较

2.3 血清N-寡糖、TBA水平和LSM值评估进展期肝纤维化的价值情况 进展期纤维化患者血清N-寡糖和TBA水平显著高于轻度纤维化患者，LSM值显著大于轻度纤维化患者(P<0.05)。绘制血清N-寡糖、TBA水平和LSM值诊断进展期肝纤维化的ROC曲线，结果显示，联合检测评估CHC患者进展期肝纤维化的AUC大于各指标单项检测(P<0.05，表3、图1)。

表3 血清指标和LSM评估进展期肝纤维化的效能(%)情况

图1 血清N-寡糖、TBA水平和LSM值评估进展期肝纤维化的ROC曲线分析

3 讨论

N-寡糖是一种新型肝脏疾病血清标志物，主要由肝脏和B淋巴细胞合成，可反映肝脏或B淋巴细胞的生理和病理学改变。健康人体血液糖蛋白上连接的寡糖结构是相对稳定的，其相对含量也基本固定。当肝脏功能出现异常时，肝脏的糖蛋白合成代谢也会有所改变，使寡糖的结构和含量发生变化[9,10]。胆汁酸的前体为胆固醇，属于一种有机酸，由多种成份构成，其合成和分解代谢主要在肝脏中完成。血清TBA的合成和分泌由肝细胞完成，是组成胆汁的主要成分，与脂类的消化、吸收密切相关[11，12]。当发生肝纤维化时，正常肝细胞遭到破坏，功能性肝细胞数量开始下降，从而使对TBA的汲取量降低[13]。同时，门静脉回流而来的TBA未得到充分的吸收。因为侧支循环的出现使门静脉中部分血液进入体循环，导致血清TBA水平升高。本研究发现，CHC患者血清N-寡糖和TBA水平升高，LSM值增大，与相关研究结果相符。在肝纤维化形成过程中，肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀而引发肝脏硬度增大[14]。本研究结果显示，进展期肝纤维化患者血清N-寡糖和TBA水平及LSM值较轻度肝纤维化患者升高，提示肝纤维化越严重，这些指标的水平就越高。

肝组织学检查依然是临床上诊断肝病患者肝纤维化的金标准，但其具有创伤性，可能存在一定的不良后果，可重复性差[15]。血清肝纤维化标记物检测是一种无创性检查方法，虽具有无创性、操作简单、可重复性高等优点，但易受其他条件的影响，准确性相对偏低[16]。相关研究指出，在血清学检查的基础上给予影像学联合检查，或可起到提高诊断准确度的作用[17，18]。本研究对不同肝纤维化患者血清N-寡糖、TBA水平及LSM值进行检测，发现随着肝纤维化程度的加重，CHC患者血清N-寡糖、TBA水平逐渐升高，LSM值逐渐增大，表明血清N-寡糖、TBA水平及LSM值与肝纤维化程度相关，主要是因为血清N-寡糖水平越高，表示肝脏受损越严重。TBA是肝脏分泌产物，其进入肠道后大部分被重吸收，从门静脉再次进入肝脏，而肝纤维化患者因肝细胞受损严重，导致其摄取TBA的功能下降，且侧支循环的存在使得富含TBA的血液绕过肝脏进入体循环，最终导致血清TBA水平增高[19，20]，提示或可通过检测血清指标及LSM值来评估肝纤维化程度。本研究发现，血清N-寡糖、TBA水平及LSM值联合检测评估CHC患者进展期肝纤维化的AUC为0.918，显著高于各单项检测，提示联合检测对CHC患者肝纤维化程度具有评估价值。本研究经进一步分析发现，确立血清N-寡糖和TBA水平及LSM的诊断截断点，评估CHC患者肝纤维化程度，具有可操作性，临床应用价值值得进一步探讨。肝纤维化是一个动态的发展过程，CHC患者肝功能受损程度随纤维化程度的加重而加重，故本研究认为，用于反映肝脏受损程度的血清N-寡糖和TBA水平或也同样可用于评估肝纤维化程度。

综上所述，CHC患者血清N-寡糖和TBA水平升高，LSM值增加，应用血清N-寡糖和TBA水平联合LSM评估CHC患者肝纤维化程度具有临床价值，值得进一步研究和验证。