急性脑出血患者血清microRNA-140-5p的水平变化及临床意义

王凯，李洪涛，胡洁滨

急性脑出血属于神经外科急危重症，是脑卒中病情最严重的类型之一，指非外伤性脑实质血管发生破裂出血，起病急，病程不稳定，致残率和病死率较高[1]。急性脑出血发生过程中伴随血肿生成，可进而引发炎症反应，加重脑部损伤，治疗后也多遗留神经功能缺损，预后普遍较差[2]。目前数据[3]显示，我国急性脑出血的发病率约为2 100～4 800/10 000人，近年呈逐年升高趋势，严重威胁我国居民身体健康。寻找具体标志物，评估急性脑出血患者的脑出血严重程度，并在早期明确预后，以便及时采取针对性治疗，对改善患者预后，提高生活质量，减轻其家庭及社会负担具有重要意义。microRNA(miRNA)是一类非编码小RNA，一般长约20～25个核苷酸，广泛存在于真核生物体中，并参与机体的生理、病理活动，与神经系统的发育及功能均密切相关[4]。有研究[5]发现，miR-140-5p可抑制IL-1β诱导的软骨细胞炎症，减少细胞凋亡，从而抑制骨关节炎进展。此外，miR-140可负调控神经炎症以减轻慢性收缩损伤大鼠的神经性疼痛[6]。近年来有人发现，脑室内注射miR-140-5p模拟物可减轻脑出血后大鼠的神经炎症和脑损伤[7]。但关于miR-140-5p与急性脑出血患者预后的关系尚鲜有报道。本研究分析miR-140-5p与急性脑出血血肿体积、神经功能缺损程度及预后的关系。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2019年7月至2020年10月本院收治的急性脑出血患者96例(观察组)作为研究对象。男55例，女41例；年龄36～78岁，平均年龄(58.63±9.45)岁；平均体重指数(BMI)(24.50±3.52)kg/m2。选取同期在本院体检健康的成年人100名(对照组)作为对照。男54例，女46例；年龄37～80岁，平均年龄(59.04±9.95)岁；平均BMI(24.16±3.77)kg/m2。两组受试者在性别、年龄、BMI方面，差异无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。纳入标准：(1)急性脑出血诊断符合《中国脑出血诊治指南(2014)》[8]，并经CT或MRI检查证实。(2)年龄>18岁，首次发病，并在发病后24 h内入院。(3)患者或其家属签署了知情同意书。(4)医院伦理委员会审核批准。排除标准：(1)合并其他疾病者，如恶性肿瘤、精神疾病、自身免疫性疾病、严重心肝肾功能不全、严重感染、血液系统疾病、内分泌系统疾病、其他脑部疾病。(2)半年内有脑出血、脑梗死等脑部病史者。(3)妊娠期及哺乳期妇女。(4)住院不满72 h离院者。(5)临床资料不全者。(6)随访不足3个月或随访期间死亡者。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器 总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、人IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒(货号：R1200-100、RP1105、SEKH-0002、SEKH-0047)购自北京索莱宝科技有限公司；实时荧光定量PCR仪(RT-qPCR)试剂(货号：abx098890)购自英国Abbexa；ABI 7500 RT-qPCR仪为美国Applied Biosystems公司产品；FLX800酶标仪为美国BioTek公司产品。

1.2.2 血液采集及miR-140-5p、炎症因子表达检测急性脑出血患者入院后抽取静脉血5 ml，对照组于体检时抽取，4 ℃离心取血清，-80 ℃保存。

采用RT-qPCR法检测血清miR-140-5p水平。将血清于冰上融化后，使用总RNA提取试剂盒提取总RNA(OD260/OD280范围为1.8～2.0)，用反转录试剂盒合成cDNA。使用RT-qPCR试剂配置反应体系，在RT-qPCR仪上进行扩增反应。miR-140-5p上游引物：5′-GAG TGT CAG TGG TTT TAC CCT-3′，下游引物：5′-GCA GGG TCC GAG GTA TTC-3′；内参U6上游引物：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。用2-ΔΔCt法表述血清miR-140-5p水平。

采用人IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒检测血清IL-1β、TNF-α水平，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.2.3 血肿体积估算 采用多田式计算公式估算血肿体积，血肿体积=π/6×长(cm)×宽(cm)×高(cm)，长、宽、高由CT或MRI测量所得。

1.2.4 神经功能缺损程度划分 根据患者入院时的NIHSS评分，将患者分为轻度神经功能缺损组(NIHSS评分<7分)、中度神经功能缺损组(7分≤NIHSS评分≤15分)和重度神经功能缺损组(NIHSS评分>15分)。

1.2.5 预后评估 根据急性脑出血患者发病3个月的mRS评分，将观察组分为预后良好组(mRS≤2分)和预后不良组(mRS评分>2分)。

2 结 果

2.1 对照组、观察组受试者血清miR-140-5p及炎症因子水平比较 见表1。 与对照组相比，观察组血清miR-140-5p水平显著降低(P<0.05)，血清IL-1β、TNF-α水平显著升高(均P<0.05)。

表1 对照组、观察组血清miR-140-5p、IL-1β、TNF-α水平的比较(x±s)组别例数miR-140-5pIL-1β(pg/ml)TNF-α(pg/ml)对照组1001.32±0.152.24±0.3936.14±5.25观察组960.55±0.127.46±1.07138.36±15.20t值39.58445.72863.430P值0.0000.0000.000

2.2 急性脑出血患者血清miR-140-5p水平与炎症因子的相关性 相关性分析结果显示，急性脑出血患者血清miR-140-5p水平与血清IL-1β、TNF-α水平均呈显著负相关(r=-0.511，r=-0.513；均P<0.05)。

2.3 急性脑出血患者血清miR-140-5p水平与血肿体积的相关性 急性脑出血患者血肿体积为(28.54±6.93)ml。相关性分析结果显示，急性脑出血患者血清miR-140-5p水平与血肿体积呈显著负相关(r=-0.469，P<0.05)。

2.4 不同神经功能缺损程度急性脑出血患者血清miR-140-5p水平的比较 见表2。 与轻度神经功能缺损组相比，中度神经功能缺损组急性脑出血患者血清miR-140-5p水平显著降低(P<0.05)；与中度神经功能缺损组相比，重度神经功能缺损组急性脑出血患者血清miR-140-5p水平显著降低(P<0.05)。

表2 不同神经功能缺损程度急性脑出血患者血清miR-140-5p水平比较(x±s)组别例数miR-140-5p轻度神经功能缺损组340.62±0.09中度神经功能缺损组400.55±0.12*重度神经功能缺损组220.43±0.07*△F值-24.088P值-0.000 注:与轻度神经功能缺损组相比*P<0.05;与中度神经功能缺损组相比△P<0.05

2.5 不同预后急性脑出血患者血清miR-140-5p水平的比较 见表3。 与预后良好组相比，预后不良组血清miR-140-5p水平显著降低(P<0.05)。

表3 不同预后急性脑出血患者血清miR-140-5p水平比较(x±s)组别例数miR-140-5p预后良好组660.59±0.11预后不良组300.44±0.08t值-6.699P值-0.000

2.6 血清miR-140-5p水平对急性脑出血患者预后的预测价值 ROC曲线分析结果显示，血清miR-140-5p水平预测急性脑出血患者预后的ROC曲线下面积为0.881(95%CI：0.814～0.947)，其截断值为0.52，敏感度为93.3%，特异度为75.8%，约登指数为0.691(图1)。

图1 ROC曲线分析血清miR-140-5p水平对急性脑出血患者预后的预测价值

3 讨 论

急性脑出血是常见于中老年人群的疾病，发病机制复杂，可由高血压、高血脂、颅内血管老化畸形等引起[9]。近年来，随着人口老龄化的加剧，高血压等疾病的发病率逐年升高，导致急性脑出血的发病率亦逐年升高。急性脑出血会形成血肿，直接损伤正常脑组织，并刺激IL-1β、TNF-ɑ等各种炎症因子分泌，造成不同程度的神经系统损伤，严重者可损害器官功能，临床表现为语言障碍、运动障碍、意识障碍、头痛、头晕等症状，严重影响患者健康及生活质量，给家庭带来沉重负担[10]。因此，早期判断并预测急性脑出血病情，并及时采取干预措施，对患者的早期恢复及预后改善具有积极意义。

miRNA可作用于靶基因mRNA的3’UTR，调控其转录后水平，广泛参与机体的病理生理过程。近年来，研究[11-12]显示，miRNA在脑血管病患者血液、脑组织中差异表达，参与脑血管病的发病及病情进展，与神经系统的发育及功能密切相关，可用于疾病预后评估。Wang等[7]研究显示，miR-140-5p可减轻脑出血后大鼠脑损伤。本研究发现，观察组急性脑出血患者血清miR-140-5p水平较对照组健康体检者显著降低，提示miR-140-5p在急性脑出血患者血清中表达异常，且其异常降低可能与患者发病有关。急性脑出血发生后，血液进入脑室可直接压迫脑室神经或脑干，造成脑组织损伤，影响患者神经功能，增加患者不良预后的概率[13]。本研究显示，急性脑出血患者血清miR-140-5p水平与血肿体积呈显著负相关，且随着神经功能缺损程度的升高，急性脑出血患者血清miR-140-5p水平逐渐降低，提示血清miR-140-5p水平与急性脑出血患者的血肿体积、神经功能缺损程度均密切相关，进而可能影响患者预后。

急性脑出血发病后常经历血肿期及脑水肿期两个阶段，其中血肿生成可引发炎症反应，而炎症反应介入脑水肿的进展并加重脑组织的继发性损伤，影响患者神经功能[14]。研究[15]显示，血液破入脑室或脑实质触发炎症信号，导致炎性细胞黏附聚集能力增强，TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎症细胞因子表达异常，并进一步发生炎症级联反应，损伤神经系统，加重脑水肿，采取针刺等治疗方式抑制炎症因子表达可减轻脑损伤。本研究显示，急性脑出血患者血清IL-1β、TNF-α水平较健康体检者显著升高，提示急性脑出血患者体内炎症反应已加重。而相关性分析结果显示，急性脑出血患者血清miR-140-5p水平与血清IL-1β、TNF-α水平均呈显著负相关，提示miR-140-5p与炎症反应关系密切，患者炎症反应加重可能与miR-140-5p表达异常降低有关。黄伊娜等[16]研究亦表明，miR-140-5p可通过调控NF-κB信号通路降低脂多糖诱导的人牙髓细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子的分泌。彭侃等[17]研究也发现，过表达miR-140-5p可降低骨关节炎大鼠软骨组织中NLRP3等炎症因子表达，发挥软骨治疗作用。Wang等[7]研究显示，miR-140-5p减轻脑出血后大鼠脑损伤与抑制Toll样受体4介导的神经炎症有关。因此，可以推测急性脑出血患者血清miR-140-5p水平的异常降低可导致炎症反应异常升高，加重脑损伤，影响神经功能。

此外，本研究结果显示，预后不良组急性脑出血患者血清miR-140-5p水平较预后良好组显著降低，提示miR-140-5p水平的异常降低不仅与血肿体积、神经功能缺损有关，还可能影响患者预后。为发掘miR-140-5p在急性脑出血中的预后价值，本研究通过ROC曲线分析发现，血清miR-140-5p水平预测急性脑出血患者预后的ROC曲线下面积为0.881(0.814～0.947)，敏感度为93.3%，特异度为75.8%，表明血清miR-140-5p水平对急性脑出血患者预后具有较好的评估价值，监测其水平有助于及时采取措施，降低预后不良风险。

综上所述，miR-140-5p在急性脑出血患者血清中显著降低，其水平与血肿体积、神经缺损程度及炎症水平相关，对预后具有一定的预测价值，可用于临床预后评估参考。但本研究尚未对miR-140-5p影响患者血肿体积、神经缺损程度及炎症水平的机制作深入探讨，下一步将进行大鼠实验以明确其相关机制。