藏红花素对慢性阻塞性肺疾病急性加重期大鼠肺组织NOD样受体蛋白3表达及血清IL-1β水平的影响

王海贺，王 璐，李 玲，王武龙

(1.巴彦淖尔市医院药剂科，内蒙古 巴彦淖尔 015000；2.包头医学院第二附属医院肿瘤科，内蒙古 包头 014030)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是由气道和肺实质慢性炎症引起的以进行性气流受限为特征的疾病。目前西医治疗COPD多采用支气管扩张剂、抗生素联合糖皮质激素治疗，可暂时缓解症状，但是COPD反复发作，难以痊愈，预后较差[1]。因此，寻找有效的治疗方法改善COPD患者预后尤为迫切。中医认为肺为娇脏，容易感邪，迁延失治，痰瘀稽留，损伤正气，急性加重期以实为主，表现为痰热，治法为清肺化痰、降逆平喘。藏红花是名贵中药材，其具有祛痰、镇静、解痉的作用。藏红花素是藏红花的活性成分，其通过抗氧化、抗炎机制对脂多糖诱导的脓毒症及其心脏毒性具有一定预防作用[2]。藏红花素可抑制COPD大鼠肺泡上皮细胞凋亡，改善气道炎症。NOD样受体蛋白3(Nod-like receptor pyrin domain 3，NLRP3)炎症小体是一种多蛋白复合物，可促进产生白细胞介素(Interleukin，IL)-1β等促炎细胞因子，进而诱发加重COPD气道炎症[3-4]。目前烟熏联合气道内滴注脂多糖，结合鼻腔给菌是诱导COPD急性加重期大鼠模型的重要方法[5]。本研究拟通过NLRP3探讨藏红花素对COPD急性加重期大鼠肺功能和炎症反应的影响，以期为临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：6周龄SPF级雄性Wistar大鼠，体重(200±20)g，动物许可证号SCXK(京)2016-0011，购自北京维通利华实验动物有限公司。大鼠饲养于24～25 ℃，湿度50%，光照、黑暗各12 h的动物房中，自由采食和饮水。

1.1.2 实验药物与试剂：藏红花素(批号YY90210)购自上海源叶生物科技有限公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(批号C1091)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)检测试剂盒(批号S0131)、乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase，LDH)释放检测试剂盒(批号C0017)、磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔单抗(批号AF1186)、NLRP3兔单抗(批号AF2155)、山羊抗兔IgG(批号A0208)、Trizol(批号R0016)、大鼠IL-1β ELISA检测试剂盒(批号P1303)购自上海碧云天生物公司；逆转录试剂盒、SYBR Green Master Mix购自北京宝日医生物公司。

1.2 实验方法

1.2.1 COPD加重期模型的制备：参照烟熏联合气道内滴注脂多糖，并结合鼻腔给菌法建立COPD急性加重期模型，即在实验第1～28天(除7、14、28 d外)将大鼠放置于玻璃烟熏箱，5%烟雾浓度烟熏30 min，然后将大鼠转移到正常环境中饲养。在实验第7、14、28天，在气管内滴入0.2 ml浓度为1 g/L的内毒素。第29～32天，鼻腔内滴注0.3 ml 2.4×109CFU/ml的金黄色葡萄球菌溶液，2次/d[5]。对照组大鼠气道和鼻腔内每次滴注等体积0.9%氯化钠溶液。

1.2.2 分组和给药：将40只大鼠随机分为对照组、模型组、藏红花素小剂量组(10 mg/kg藏红花素)、藏红花素大剂量组(50 mg/kg藏红花素)，每组10只。在实验第4天烟熏前1 h，藏红花素小、大剂量组大鼠分别腹腔注射10、50 mg/kg的藏红花素溶液[6]，每日1次，直到造模结束。造模结束24 h后进行肺功能检测，抽取动脉血，摘取肺组织。

1.2.3 肺功能指标检测：用10%水合氯醛腹膜内麻醉大鼠，固定头部和四肢，颈部消毒后，钝性逐层分离颈部皮下组织直至气管暴露，气管插管，连接FGC-A+型全自动肺功能测试仪，记录大鼠的0.3秒用力呼气容积与用力肺活量比值(FEV0.3/FVC)、呼气峰流量(Peak expiratory flow，PEF)以及吸气峰流量(Peak inspirator flow，PIF)[7]。

1.2.4 TUNEL染色检测大鼠肺组织肺泡上皮细胞凋亡：将肺组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，随后切成4 μm厚组织切片。二甲苯脱蜡后，入梯度乙醇直至水化。按照TUNEL试剂盒步骤染色。每个切片随机选择5个视野计数，以凋亡细胞和视野总细胞数目的比值表示细胞凋亡率。

1.2.5 比色法检测大鼠血清MDA、LDH水平：抽取大鼠动脉血，25 ℃静置60 min，2000 r/min离心20 min后分离血清，采用MDA检测试剂盒、LDH活性检测试剂盒检测大鼠血清MDA、LDH水平。

1.2.6 Western blot检测肺组织NLRP3蛋白表达：RIPA法提取肺组织总蛋白，定量后进行SDS-PAGE，湿法转膜后，脱脂奶粉封闭，随后依次加入一抗(NLRP3抗体1∶1000稀释，GAPDH抗体1∶2000稀释)和二抗(1∶1000稀释)进行免疫反应，然后加入化学发光试剂显色。以GAPDH为内参，用Image J软件分析目标条带的相对灰度值。

1.2.7 RT-qPCR检测大鼠肺组织NLRP3 mRNA表达：以Trizol试剂提取肺组织总RNA，用逆转录试剂盒将1 μg总RNA反转录为cDNA，利用SYBR Green Master Mix配制20 μl反应体系，采用CFX96 Real-Time PCR检测系统检测NLRP3 mRNA表达。用2-△△Ct法分析NLRP3 mRNA相对表达量。NLRP3上游引物5’-CAGCGATCAACAGGCGAGAC-3’，下游引物5’-AGAGATATCCCAGCAAACCTATCCA-3’；GAPDH上游引物5’-GAACATCATCCCTGCATCCA-3’，下游引物CCAGTGAGCTTCCCGTTCA-3’。

1.2.8 ELISA检测血清IL-1β水平：按照ELISA试剂盒说明书检测各组大鼠血清IL-1β水平。

2 结 果

2.1 各组大鼠肺功能指标比较 与对照组比较，模型组大鼠PEF、PIF、FEV0.3/FVC均显著降低(P<0.05)；与模型组比较，藏红花素小、大剂量组大鼠PEF、PIF、FEV0.3/FVC均显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠肺功能指标比较

2.2 各组大鼠肺组织肺泡上皮细胞凋亡率比较 对照组、模型组和藏红花素小、大剂量组大鼠肺组织肺泡上皮细胞凋亡率分别是(2.99±0.14)%、(35.05±2.28)%、(24.40±1.32)%、(11.21±0.86)%。与对照组比较，模型组大鼠肺泡上皮细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与模型组比较，藏红花素小、大剂量组大鼠肺泡上皮细胞凋亡率均显著降低(P<0.05)(图1)。

图1 各组大鼠肺组织肺泡上皮细胞凋亡情况(TUNEL染色，×400)

2.3 各组大鼠血清MDA、LDH水平比较 与对照组比较，模型组大鼠血清MDA和LDH水平均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，藏红花素小、大剂量组大鼠血清MDA和LDH水平均显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清MDA、LDH水平比较

2.4 各组大鼠肺组织NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白表达比较 与对照组比较，模型组大鼠肺组织NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白水平均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，藏红花素小、大剂量组大鼠肺组织中NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白水平均显著降低(P<0.05)。见表3(图2)。

表3 各组大鼠肺组织NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白表达比较

图2 各组大鼠肺组织NLRP3蛋白表达

2.5 各组大鼠血清IL-1β水平比较 干预后，对照组、模型组及藏红花素小、大剂量组大鼠血清IL-1β水平分别为(50.14±1.66)、(273.61±18.73)、(188.83±14.20)、(92.52±9.07)pg/ml。与对照组比较，模型组大鼠血清IL-1β水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，藏红花素小、大剂量组大鼠血清IL-1β水平均显著降低(P<0.05)。

3 讨 论

慢性支气管炎和气道阻塞是COPD的主要病理特征，吸烟、感染等有害刺激可诱发肺部异常炎症，加重COPD患者呼吸道症状，降低肺功能。研究指出，中药及其活性成分通过抑制氧化应激和炎症反应保护肺功能[8]。肺功能检测是评估COPD病情严重程度、预后及评定疗效的重要方法[9-10]。本研究发现，与模型组比较，藏红花素处理后大鼠PEF、PIF、FEV0.3/FVC显著升高，且与藏红花素剂量呈正相关，表明藏红花素可改善COPD急性加重期大鼠的肺功能。COPD患者及大鼠肺泡上皮细胞异常凋亡与肺组织病理改变或肺功能改变有关[11]。本研究结果显示，藏红花素处理后，COPD急性加重期大鼠肺泡上皮细胞凋亡率显著降低，这与藏红花素处理后肺功能得到改善相吻合。慢性炎症是COPD发病的核心机制，COPD急性加重期患者血清和肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6等促炎因子水平显著增加，其与巨噬细胞活化和中性粒细胞炎症浸润有关[12]。已有报道显示，西红花苷可减轻博莱霉素诱导的肺纤维化模型大鼠的炎症反应和肺血管功能障碍[13]。同时，藏红花素可通过改善抗氧化防御，减少促炎介质TNF-α、IL-1β产生，抑制甲氨蝶呤诱导的肝毒性反应[14]。本研究中，藏红花素以剂量依赖方式抑制大鼠血清中促炎因子IL-1β、脂质过氧化副产物MDA水平以及细胞损伤标志物LDH水平，表明藏红花素通过抑制氧化应激和炎症反应进而改善COPD急性加重期大鼠肺功能。

NLRP3是一种细胞内受体，其通过与PAMP等结合激活Caspase-1诱导促炎因子IL-1β和IL-18活化和释放，介导宿主促炎反应，参与COPD等呼吸系统疾病进展[15]。研究表明，COPD动物模型肺组织NLRP3表达水平与肺功能损伤程度相关[16]。COPD患者血清IL-1β水平升高，且其表达水平与疾病严重程度相关[17]。氧化应激可介导NLRP3炎性小体活化促进COPD进展[18]。藏红花素通过抑制NLRP3信号通路减轻脂多糖诱导的焦虑和抑郁样行为，改善大鼠糖尿病肾病相关的炎症和氧化应激反应[19-20]。本研究中藏红花素处理后，大鼠肺组织NLRP3水平显著降低，血清IL-1β水平降低，表明藏红花素可能通过下调NLRP3表达改善COPD患者肺功能。

综上所述，藏红花素通过下调NLRP3表达改善COPD急性加重期大鼠的肺功能，抑制氧化应激和炎症反应，抑制肺泡上皮细胞凋亡。