中药制剂702糖浆薄层色谱鉴别与含量测定*

2022-07-13何佩贞黄春喜何成章蔡丹昭

广西医科大学学报 2022年6期

何佩贞，黄春喜，何成章，蔡丹昭，罗捷，罗育△

（1.广西医科大学第一附属医院药学部，南宁 530021；2.广西医科大学基础医学院，南宁 530021）

702糖浆是广西医科大学第一附属医院生产的院内制剂，由何首乌、鸡血藤、钩藤、夜交藤、生地黄等中药材提取制成，具有养血安神、清热除烦等功能，在临床使用中，疗效确切，服用便利，处方工艺简略等中药制剂的优势，患者依从性高。本方中的何首乌具补益肝肾、补益精血、强筋骨、乌须发、化浊降脂等作用，临床用于抗衰老、提高免疫力、降血脂、保护心血管及抗皮肤脂质过氧化等[1-3]；而鸡血藤具有清热解毒、凉血活血、舒经活络的作用，并显示出促进造血功能、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等多种药理活性，临床上使用率较高[4-6]；另外，钩藤具有清热平肝、息风定惊、降压降血的功效[7-9]。

2017年以来，国家高度重视医院制剂的研发和使用，并鼓励研发使用医院制剂，医院制剂的大量研发生产，也面临质量控制等问题，为了更好地控制药品质量，保证用药安全，本研究采用薄层色谱层析法（TLC）对医院制剂702糖浆中的何首乌、鸡血藤、钩藤进行鉴别。何首乌为本方的君药，其中2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷（简称二苯乙烯苷）是本制剂产生疗效的重要成分之一，可以作为该制剂质量控制的指标成分[10]。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）对何首乌中二苯乙烯苷的含量进行测定，为本方制剂的质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

LC-20A型岛津高效液相色谱仪（日本岛津公司），UVG20透射防护盖紫外分析仪（上海领成生物科技有限公司），超声清洗机（广州市科洁盟实验仪器有限公司）。

1.2 试药

二苯乙烯苷对照品（中国食品药品检定所研究院，批号：110844-201512），何首乌对照药材（批号：B25786）、鸡血藤对照药材（批号：B26132）、钩藤对照药材（批号：B25585）均购于上海源叶生物科技有限公司，702糖浆（由广西医科大学第一附属医院药学部提供，批号：20160428、20170718、20201215），阴性样品（按处方自制），水为纯化水，乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。

1.3 TLC鉴别

1.3.1 何首乌取20 mL糖浆，加100 mL乙酸乙酯，50℃超声30 min，取乙酸乙酯液层，旋转蒸发仪浓缩至约5 mL，蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解作为供试品溶液。取1 g何首乌对照药材，同法制备其对照药材溶液。取缺何首乌的阴性样品，同法制备其阴性对照溶液。吸取供试品溶液、对照药材溶液和阴性对照品溶液各5μL，分别点于同一硅胶H薄层板上，先用三氯甲烷∶甲醇（7∶3）作为展开剂，层析缸中展开至约2.5 cm，取出，晾干，再以三氯甲烷∶甲醇（20∶3）为展开剂，层析缸中展开至约7 cm，取出，晾干，在紫外光（365 nm）下检视。

1.3.2 鸡血藤取20 mL糖浆，用乙酸乙酯振摇萃取3次，每次50 mL，将3次萃取得到的乙酸乙酯液合并，在旋转蒸发仪回收乙酸乙酯至约5 mL，再蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解作为供试品溶液。取2 g鸡血藤对照药材，同法制备其对照药材溶液。取缺鸡血藤的阴性样品，同法制备其阴性对照溶液。吸取供试品溶液、对照药材溶液和阴性对照品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，用三氯甲烷∶甲醇（20∶1）为展开剂，层析缸中展开，取出，晾干，在紫外光（365 nm）下检视。

1.3.3 钩藤取20 mL糖浆，加4 mL浓氨水，浸泡30 min后，加入40 mL氯仿，水浴加热回流1 h，取氯仿层，旋转蒸发仪回收氯仿至约3 mL，再用蒸发皿蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解作为供试品溶液。取2 g钩藤对照药材，同法制备其对照药材溶液。取缺钩藤的阴性样品，同法制备其阴性对照溶液。吸取供试品溶液、对照药材溶液和阴性对照品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇（10∶4∶1）为展开剂，层析缸中展开，取出，晾干，在紫外光（365 nm）下检视。

1.4 含量测定

1.4.1 色谱条件参照中国2020年版药典四部通则0512中HPLC试验，使用InertSustain®C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相为乙腈∶水（25∶75)，柱温为30℃，流速为1 mL/min，检测波长为320 nm。理论塔板数按何首乌二苯乙烯苷计算，应不低于3×103。

1.4.2 溶液配制精密称取11.53 mg二苯乙烯苷对照品，置10 mL容量瓶中，加50%乙醇溶解并定容，摇匀，制得1.153 mg/L对照品储备液。精密吸取2 mL 702糖浆，置100 mL容量瓶中，加乙醇适量，超声处理5 min，取出冷却，加乙醇定容，定量滤纸过滤，取滤液，0.22μm微孔滤膜过滤，收集过滤液，制得供试品溶液（在12 h内使用）。取缺何首乌的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液。

1.4.3 方法学考察专属性试验：在“1.4.1项”下色谱条件，分别精密吸取何首乌二苯乙烯苷对照品、供试品、阴性对照溶液各20μL，进样，测定，记录色谱图。

线性关系：精密吸取对照品储备液及将其依次稀释配成1.014 6μg/mL、2.006 0μg/mL、5.003 9μg/mL、10.007 8μg/mL、14.988 6μg/mL、19.992 5μg/mL、25.019 4μg/mL的标准液，进样测定，记录色谱图。以峰面积为纵坐标，浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归。

精密度、稳定性与重复性：精密量取20μL对照品溶液置于高效液相色谱仪中，平行进样6次，测得二苯乙烯苷的平均峰面积值；精密吸取同一供试品溶液（批号：20170718），分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h进样，记录峰面积；精密量取同一批号（批号：20170718）6份样品，按供试品制备方法制备，进样，记录色谱峰面积。

加样回收率：精密量取3份702糖浆（批号：20170718），每份2 mL，按供试品溶液制备方法制备，每份供试品溶液再平均分成3份，各份分别精确加入25μL、69μL、105μL对照品储备液，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，进样，记录色谱峰面积并测定二苯乙烯苷含量。

1.4.4 样品二苯乙烯苷含量分别精密量取3批702糖浆样品（批号：20160428、20170718、20201215），每份2 mL，进样，记录色谱峰面积，通过峰面积从标准曲线上查出对应含量，并利用查出值乘以1 000，然后除以2 000，计算各批样品中二苯乙烯苷的含量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（）表示，样品批次间比较采用两独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TLC鉴别

702糖浆剂中何首乌的TLC鉴别结果显示，在供试品与对照品方框中对应位置上有两处显示淡红色斑点，阴性对照相应位置上无此斑点，见图1A。702糖浆中鸡血藤的TLC鉴别结果显示，在供试品与对照品方框中对应位置上有两处显示淡红色斑点，阴性对照相应位置上无此斑点，见图1B。

702糖浆中钩藤的TLC鉴别结果显示，供试品与对照方框中相应位置上有3处显示淡青色斑点，阴性对照相应位置上没有相应斑点或不明显，见图1C。

图1 702糖浆的薄层色谱图

2.2 HPLC方法学考察

2.2.1 专属性试验供试品中二苯乙烯苷色谱峰为保留时间为7.597 min，阳性对照品色谱峰的保留时间为7.615 min，两者保留时间基本一致，而阴性对照品在相应位置上无色谱峰，见图2。说明本研究制剂中其他成分对二苯乙烯苷的含量测定无干扰，方法专属性强。

图2 HPLC图

2.2.2 线性关系试验以峰面积（Y）为纵坐标，进样量（X，μg）为横坐标进行线性回归，得回归方程为：Y=820 63X+1 073（r=0.999 9），据此可知二苯乙烯苷在1.014 6～25.019 0μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，见图3。表明本法适用于二苯乙烯苷的含量测定。

图3 HPLC测定二苯乙烯苷含量的标准曲线

2.2.3 精密度试验精密量取20μL对照品溶液置于高效液相色谱仪中，平行进样6次，测得二苯乙烯苷的平均峰面积值为658 048，RSD为0.033%，见表1。表明所用仪器精密度符合要求。

表1 精密度考察结果 n=6

2.2.4 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液（批号：20170718），分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h进样，记录峰面积，计算得12 h内二苯乙烯苷的平均峰面积为725 606.1，RSD为0.489 6%，见表2。表明供试品溶液在配制后12 h内稳定性良好。

表2 稳定性考察结果 n=7

2.2.5 重复性试验精密量取同一批号（批号：20170718）6份样品，按供试品制备方法制备，进样，记录色谱峰面积。测得二苯乙烯苷的平均峰面积值为368 324，RSD为1.19%，见表3。根据2020年版《药典》规定HPLC法测定二苯乙烯苷含量的稳定性RSD应小于2%，表明本法的重复性良好。

表3 重复性考察结果 n=6

2.2.6 加样回收试验二苯乙烯苷的平均回收率为99.6%，RSD为1.58%，见表4。表明方法准确度较好。

表4 加样回收率考察结果 n=6

2.3 样品含量测定

3批702糖浆样品（批号：20160428、20170718、20201215）的二苯乙烯苷含量分别为4.771μg/mL、4.722μg/mL、4.642μg/mL，3批样品中的二苯乙烯苷含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表5。

表5 HPLC法测定702糖浆中二苯乙烯苷含量 n=3

3 讨论

3.1 TLC鉴别

702糖浆为纯中药制剂，组分复杂，但疗效确切，其中何首乌为君药，鸡血藤、钩藤为臣药，这3种药是保证疗效的主要成分，参考2020年版《药典》及相关文献[10-14]，经过不断试验调整，最终确定薄层色谱条件。对何首乌的鉴别，《药典》使用的是硅胶H薄层板，因此本研究选择使用此种薄层板，但是鉴别效果不理想，而在没有更换薄层板的前提下，通过调整展开剂（三氯甲烷∶甲醇）的浓度进行层析，先用展开剂比例为7∶3进行展开，然后将展开剂的比例调整为20∶3进行展开，得到层次分明、背景干净的结果，可用于本制剂中何首乌的鉴别；对鸡血藤的鉴别，《药典》使用的展开剂是三氯甲烷∶甲醇，但两者比例为10∶1，达不到分离效果，因此将展开剂调整为20∶1，使得薄层斑点间分离度得到改善，可用于本制剂中鸡血藤的鉴别；对钩藤的鉴别，最初使用的展开剂是石油醚（60～90℃）∶丙酮（9∶6），紫外检视下有斑点，但清晰度较差，显色也非常差，之后调整展开剂为氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇（10∶4∶1），同样条件下紫外检视，得到斑点清晰的色谱图，分离效果较好，阴性对照无干扰，可用于本制剂中钩藤的鉴别。

3.2 含量测定方法

何首乌为该制剂的君药，其中二苯乙烯苷为何首乌有效成分之一，因此选用测定二苯乙烯苷含量的方法来反映该制剂的质量。目前，分析二苯乙烯苷的方法很多[15-17]，常用的方法有HPLC法、高效毛细管电泳法、紫外分光光度法、酶化学发光法等，其中紫外分光光度法和高效毛细管电泳法较为复杂，很少使用，酶化学发光法要求高，且昂贵，而HPLC法无需事先分离就可直接用于测定含量[18]，样品直接稀释即可测定，且受溶液酸碱度等因素影响较小，考虑到该中药制剂含有多种复杂组分，单个成分难以提取，因此选择HPLC法作为本制剂中二苯乙烯苷的含量测定方法。本研究结果表明，不同批次的样品中二苯乙烯苷的平均含量无明显差异，2020年版《药典》规定其含量生首乌不应低于1%，制首乌不应低于0.7%，本研究中3个批次的样品二苯乙烯苷含量稳定，符合用药要求，可以保证临床疗效。