二代测序技术在脓毒症病原学诊断中的应用价值

查渝，曹晓光，戴媛媛，黄羽，王春艳，周树生

中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院),a 急救中心ICU,b 细菌室,合肥 230001

脓毒症是重症医学科(ICU)最常见的病症，是导致重症患者死亡的主要原因之一[1]。近年来，其发病率呈上升趋势[2]。脓毒症治疗的核心环节是病原体的早期识别和有效抗菌药物的尽早应用[3-6]。目前病原学诊断方法常用的有细菌培养和病原体遗传物质检测技术[包括基因探针技术、聚合酶链反应(PCR)技术]，在特异性、敏感性和诊断时间等方面各有优势。二代测序技术(NGS)可同时针对上百万个核酸片段进行检测，可快速、准确检测出样本中所有病原体尤其是非典型、罕见病原体等[7-8]。由于缺乏公认的判断标准，导致其在临床运用上存在认识差异。本研究分析了2018年1月至2022年1月某三级甲等教学医院收治82例疑似脓毒症患者，并将NGS与血培养和PCR等检测结果进行对比，进一步明确NGS临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2018年1月至2022年1月某三级甲等教学医院收治住院的82例疑似脓毒症患者临床资料。排除标准：(1)血细菌培养、NGS结果考虑为标本污染和数据严重缺失患者；(2)所有病原体检测结果的解读均由3名ICU高级职称医师共同商议后决定，意见不统一的病例。检测时间为标本送检至出具报告所需时间。

1.2 脓毒症诊断标准及病原体判定 脓毒症诊断根据Sepsis 3.0标准，初始入组标准为发热伴有快速序贯脏器衰竭评分(qSOFA)≥2分，最终诊断标准为感染+序贯脏器衰竭评分(SOFA)≥2分[9]。病原体的判定参照《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床运用专家共识(2020)》[10]推荐意见，结合患者血细菌培养、PCR检测、临床表现及辅助检查结果，由3名ICU高级职称医师共同商议后确认致病病原体。

1.3 仪器与试剂 全自动血培养仪及配套血培养瓶(美国BD公司)，VITEK-32全自动微生物分析仪及配套鉴定药敏卡VITEK MSTM 质谱仪(法国VITEK公司)，GTQ-Cycler扩增仪(德国海恩公司)，DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)，ABI7500 荧光定量PCR仪(北京六一仪器厂)，GIS凝胶图像分析仪(上海天能公司)。二代测序及生物信息学分析由华大基因研究所完成。PCR引物序列：HSV(武汉百泰)、EBV和CMV(达安基因)。

1.4 血培养及PCR检测 血培养的采集参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)的血培养临床实践指南。对疑似脓毒症的患者，从不同穿刺位点平均采集2套标本进行血培养，采集的血液被立即注入需氧瓶和厌氧瓶(每瓶8～10 mL血液)。血培养瓶用全自动血培养仪培养5 d，对培养阳性的标本及时转种到哥伦比亚血平板、巧克力平板及麦康凯平板。培养出的微生物使用VITEK-32全自动药敏分析仪进行药敏试验。PCR检测病原体：将血标本离心后，取0.5～1 mL血浆加入50 μL DNA提取液混匀，100 ℃水浴10 min后离心，取上清液按照试剂盒说明书设置PCR反应条件。

1.5 NGS检测

1.5.1 样本处理和核酸提取 取1～2 mL新鲜血液标本，经玻璃珠混合震荡后提取DNA标本进行文库的构建。

1.5.2 文库构建和测序 采用Agilent 2100 Bioanalyzer 质控文库插入片段大小，采用Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher，美国)质控DNA文库浓度，经环化形成单链环形结构。环化后的文库经滚环复制(RCA)生成DNB 纳米球。制备好的DNB纳米球加载到测序芯片，采用BGISEQ-500进行测序。

1.5.3 数据分析 测序数据下机后去除低质量的和长度<35 bp的数据以获得高质量的数据，将高质量数据中比对上人参考基因组序列的数据去除，剩下的数据去除低复杂度reads后与专用的微生物大数据库比对，并将比对后的数据按照病毒、细菌、真菌和寄生虫等进行分类和排列。

1.6 统计学方法 采用SPSS 18.0统计学软件分析数据。非正态分布的计量资料以M(P25，P75)表示，采用Mann-Whitney检验；计数资料用例数及百分比表示，采用χ2检验。使用MedCalc 18.11.3软件，用Delong法绘制受试者工作特征(ROC)曲线计算灵敏度、特异度及曲线下面积(AUC)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 82例患者中，男性53例，女性29例；年龄14～96岁。所有患者均采用NGS和血培养检测，32例患者采用PCR分子鉴定法。诊断为脓毒症患者62例(脓毒症组)，非脓毒症患者20例(非脓毒症组)。脓毒症组NGS和血培养阳性率均高于非脓毒症组(NGS：80.65%比55.00%;血培养：19.35%比0)，组间差异有统计学意义(P<0.05)。对预后的影响，62例脓毒症患者中35例(56.45%)未治愈，明显高于非脓毒症(25.00%)，组间差异有统计学意义(P<0.05)；余指标组间差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1、表2。

表1 脓毒症组与非脓毒症组相关资料比较

表2 疑似脓毒症患者82例预后相关资料比较

2.2 血培养及PCR结果分析 82例患者血培养检测时间为(5.61±1.22)d，共计12例患者阳性，阳性率14.63%，共计13种病原体，分别为：肺炎克雷伯杆菌3例、铜绿假单胞菌杆菌2例、大肠杆菌2例，鲍曼不动杆菌、伯克霍尔德菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、溶血葡萄球菌各1例，白色假丝酵母1例。32例患者进行了PCR检测，检测时间为(1.52±0.31)d，检测结果为：巨细胞病毒(CMV)4例、人类疱疹病毒(EBV)5例。

2.3 NGS结果分析 82例NGS检测结果中共有61例呈阳性，阳性率为74.39%；平均检测时间为(1.32±0.26)d；其中，常见病原菌有金黄色葡萄球菌4例，肺炎克雷伯杆菌14例和鲍曼不动杆菌10例；常见病毒为CMV 22例、EBV 13例和单纯疱疹病毒1型(HSV-1)13例；真菌及其他病原体常见为耶氏肺孢子菌8例、烟曲霉5例、问号钩端螺旋体3例和军团菌2例。

2.4 NGS与血培养、PCR结果之间的比较 对比NGS与血培养的检测结果，其中35例结果完全一致，47例结果不完全一致；不完全一致结果主要包括病毒、真菌、衣原体、支原体以及其他病原体。82例患者中，45例患者NGS检测出1种以上病原体，1例患者血培养检测出2种病原体；NGS检测出病原体阳性率明显高于血培养，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 不同方法检测脓毒症病原体结果比较[例(%)]

以脓毒症临床诊断为“金标准”，绘制ROC曲线，NGS和血培养AUC、灵敏度和特异度分别为0.628、80.6%、45.0%和0.597、19.4%、100%；阳性预测值和阴性预测值分别为82.0%、42.9%和100%、28.6%。PCR灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和AUC分别为36.4%、90.0%、88.9%、39.1%和0.632。

3 讨论

脓毒症是目前重症患者的主要死亡原因之一[11]。本研究结果显示，脓毒症组患者有35例未治愈，占56.45%，明显高于非脓毒症组重症患者的25.00%，这和相关研究结果[1-2,8,11]基本一致。脓毒症患者合并多器官功能障碍，好发于高龄、有慢性基础疾病的患者；此类患者病情进展快，短时间内难以获知准确的病原体常因抗感染治疗方案不够精准等因素导致预后不良[12-13]，尽快获得病原学诊断是目前临床研究的难点。

在脓毒症患者中，血培养是目前临床医生最常用的获得病原体的方法，也是诊断血流感染的金标准[9]。但在脓毒症或感染性休克的患者中，只有一小部分患者的血培养呈阳性[14]；重症患者血培养阳性率在25%左右[15]。但本研究中，脓毒症患者血培养阳性率为19.35%，低于文献报道水平。血培养阳性率与患者是否存在血流感染、血标本留取前抗感染药物的使用和是否在寒战高热时采集标本等因素有关；同时血培养标本采集技术缺陷以及局部病灶、特殊病原体，血液中病原菌浓度低也是影响血培养阳性率低的重要原因。

本组资料中，NGS阳性率为74.39%，明显高于血培养的阳性率。研究[16-17]表明，由于NGS检测病原体核酸片段不受病原体活力及抗感染药物暴露的影响,检测阳性率高于传统的检测方法。此外，临床血培养阳性率低的另一个原因为苛养菌、非细菌、真菌等病原体由于培养时间长或无法通过常规细菌培养获得明确病原体结果。本研究结果表明，细菌类病原体只占病原体的一部分，细菌类常见病原体以鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌等占比最高。与血培养相比，NGS不仅能诊断出细菌、真菌类病原体，对病毒感染、罕见病菌及混合感染的检测具有更大优势。本研究表明，NGS检测出2种及以上病原体占54.88%，远高于血培养。血培养报告单一病原体的原因还与不同病原体在培养过程中存在竞争性生长等有关[14]，而NGS可检测出多个核酸片段，不受该因素影响[16-17]。

本研究NGS检测结果中检测出现多种病毒，主要包括CMV、EBV、HSV-1等；常规血细菌培养无法检测出病毒，目前临床病毒检测主要依赖于PCR和抗体检测，虽然PCR和抗体检测方法常作为诊断主要依据，但其存在严重缺陷，需临床医生先预判病原体种类，再进行针对性的PCR扩增或抗体检测，受限因素较多，检测阳性率低。NGS检出病毒主要包括CMV、HSV、EBV以及其他临床不常见病毒，阳性例数及检测种类明显高于PCR技术检测结果。NGS的AUC、灵敏度和特异度分别为0.628、80.6%、45.0%，较PCR的0.632、36.4%、90.0%，灵敏度高而特异度较低。病毒感染在脓毒症中的地位仍不明确，部分学者研究建议[18]，病毒检测应作为重症患者病原体检测的重要组成部分，以指导更加精准的抗感染诊疗方案制定；部分脓毒症患者常存在病毒与细菌混合感染，此类患者病情更为严重。

NGS在检测时间上优势明显，需(1.32±0.26)d，明显低于血培养的(5.61±1.22)d。国外研究[19]报道NGS检测周期最短约为6 h。脓毒症患者病情危重、进展快速，故早期、精准地抗感染治疗对于改善患者预后、降低患者病死率至关重要[12]；同时精准地抗感染治疗对改善全球愈发严重的抗菌药物滥用问题[20]有着促进作用。因此，NGS早期运用，尤其对考虑常规检测方法效果不佳、需快速获得病原体的重症患者意义更大。

本研究不足之处：(1)对于NGS和血培养结果判读，仍缺乏统一的标准来识别检测到的微生物是否为病原菌，本研究中，虽然由3位高级职称医师根据患者的临床特点结合其他辅助检查结果得出，但主观偏见仍然不可避免。(2)NGS灵敏度高，在检测过程中需要严格的无菌操作，否则容易导致临床误判。(3)由于检测引物限制，在本次研究中PCR送检目标均为考虑病毒感染患者，影响研究结果程度难以有效确定。本研究为单中心研究，样本量较小，研究结论还需要在大规模的临床研究中进一步验证。